许影 高雅 杨春燕 朱东茂 张银田 李威儒 平宝红
南方医科大学南方医院1惠侨医疗中心,2血液科(广州510515)
干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)主要由自然杀伤细胞(nature killer cells,NKs)和活化的T 细胞分泌,具有免疫激活、诱导免疫耐受、调节免疫抑制的功能[1]。IFN-γ 是促炎性因子中重要成分,在炎症性疾病尤其移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)病理发生、发展过程中发挥核心作用[1-2]。IFN-γ可通过诱导吲哚胺2,3-二氧化酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)途径调节免疫细胞的适应性或固有性免疫反应,也可调节间充质干细胞(mesenchymal stromal cells,MSCs)的免疫功能[1,3]。
MSCs 发挥免疫调节作用需要炎症微环境中IFN-γ的激活[3]。IFN-γ预处理的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stromal cells,BMMSCs)不仅上调IL-6、IL-8 等炎症抑制因子表达及分泌[4],而且IFN-γ激活的BMMSCs 显著预防和抑制GVHD 的发生、进展[5]。目前临床防治GVHD 的MSC 主要来源于骨髓[6],但BMMSCs 的临床应用面临许多挑战,如采髓有创伤性,细胞活力受供者年龄等因素影响[4]。人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cell,hAMSC)来源于健康孕妇剖宫产后废弃物——胎盘羊膜,易于获得,数量丰富。免疫表型鉴定表明,hAMSCs与BMMSCs相似,具有免疫调节特性,hAMSCs 比BMMSCs 有更强的增殖能力及干细胞特性,可能为GVHD 的防治提供一种新的种子细胞来源[7-9]。但目前IFN-γ对hAMSCs 的生长、增殖以及免疫调节的影响少有报道。因此,本研究拟在hAMSCs 培养基中加入不同浓度IFN-γ,分析IFN-γ对hAMSCs 的增殖能力、凋亡情况及炎性因子分泌的影响,为GVHD 防治提供一个新策略。
1.1 材料及主要试剂
1.1.1 胎盘组织 共两份,均经知情同意,获取于南方医院妇产科足月剖宫产的健康孕妇。无菌保存3 h 内进行分离。
1.1.2 主要试剂 α-MEM 培养基、胎牛血清(FBS)、EDTA-胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(PBS)(Gibco),青霉素-链霉素双抗、非必需氨基酸、L-谷氨酸(Sigma),人重组IFN-γ因子(Peprotech),流式荧光抗体(Gibco),CCK-8 试剂盒(Dojindo),SSEA-4 免疫荧光抗体(abcam),Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(MultiSciences),PGE-2 试剂盒(elabscience)、sHLA-G 试剂盒(Exbio)。
1.1.3 主要仪器 流式细胞分析仪(BD LSRFortessa X-20),microplate reader(BioTekCytation5),FlowJo V10 software(FlowJo LLC),显微镜(Olympus CKX53)。
1.2 分离和培养hAMSCs 钝性剥离新鲜胎盘的部分羊膜,剪成大小约6 cm × 6 cm 组织块,0.25%胰蛋白酶-EDTA 37 ℃水浴消化2 次,分别为10、15 min,PBS 漂洗尽量去除羊膜上皮细胞,剪碎消化后的组织块至大小约1 mm×1 mm,平铺至培养瓶中静置1 h 贴壁,加入适量α-MEM 完全培养基培养,随后每3 天换液,待贴壁细胞生长密度为70%~80%时传代,记为P1,传代后贴壁细胞生长融合80%~90%时再传代,记为P2,以此类推。倒置显微镜下观察细胞生长形态。第3~6 代hAMSCs 用于本实验。
1.3 hAMSCs免疫表型鉴定 取第4代hAMSCs制成1×105/mL 单细胞悬液,在每管100 μL 的单细胞悬液中加入鼠抗人单克隆抗体CD90APC、CD73PE、CD34APC、CD45FITC、CD105 FITC、CD11bPE、HLADRPC7 各20 μL,室温避光孵育30 min,PBS 洗涤重悬后,流式细胞仪上机检测。
1.4 hAMSCs 免疫荧光检测 取第4 代hAMSCs制作细胞爬片,4%多聚甲醛固定15 min,0.2% Tritonx-100、5% BSA 通透封闭40 min,加入抗SSEA-4一抗,4 ℃湿盒孵育过夜,羊抗鼠IgG/Cy3 二抗室温避光孵育1 h,DAPI 核染色,室温避光孵育2 min,封片,荧光显微镜下观察拍照。
1.5 hAMSCs增殖能力 按照IFN-γ冻干粉试剂说明书溶解、稀释IFN-γ,最终浓度分别为10、30、50、70、100 ng/mL。含不同浓度IFN-γ的α-MEM 完全培养基培养hAMSCs,调整细胞浓度为1×104/mL,按每孔100 μL 接种于96 孔板中,各组设3 个复孔,每天取1 组细胞,加入10 μL CCK-8 避光孵育2 h,酶标仪测450 nm 处OD值,连续检测6 d,绘制生长曲线。
1.6 细胞凋亡分析 取第5 代hAMSCs,调整细胞浓度为1 × 105/mL,含不同浓度IFN-γ的α-MEM 完全培养基培养48 h,0.25%胰蛋白酶(无EDTA)消化3~4 min,PBS 洗涤后离心,500 μL Binding Buffer 重悬细胞沉淀,各管中分别加入5 μL Annexin V-APC and 5 μL PI,混匀室温避光孵育10 min,流式细胞仪上机检测。
1.7 细胞因子分析 调整细胞浓度为5×104/mL,不同浓度IFN-γ 的α-MEM 完全培养基培养hAMSCs,培养48 h,收集各组细胞培养上清液,ELISA检测PGE-2、sHLA-G 水平,紫外分光光度法检测KYN 水平,具体操作均参考试剂说明书。
1.8 统计学方法 实验数据采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析,以均数±标准差表示,多组差异比较用单因素方差分析,P<0.05 表示差异有统计学意义。
2.1 hAMSCs 细胞形态及鉴定 组织块法培养的原代hAMSCs 及传代后的hAMSCs 均呈梭形、成纤维样,克隆性增殖。hAMSCs 表达CD90、CD73、CD105,不表达CD34、CD45、CD19、CD11b、HLADR(图1A);及表达人胚胎表面抗原SSEA-4(图1B)。
图1 hAMSCs 免疫表型及免疫荧光鉴定Fig1 Identification of immunophenotype and immunofluorescence of hAMSCs
2.2 不同浓度IFN-γ 对hAMSCs 增殖的影响 随着IFN-γ 浓度的增加,hAMSCs 增殖能力未受到明显影响。无IFN-γ 组和含不同浓度IFN-γ 组中hAMSCs 的增殖从第1 天至第4 天,均快速生长,随后生长速度减慢(图2)。
图2 不同浓度IFN-γ 对hAMSCs 增殖能力的影响Fig2 Effects of different concentration of IFN-γ on the proliferation of hAMSCs
2.3 IFN-γ 对hAMSCs 凋亡的影响 IFN-γ 浓度为100 ng/mL 培养hAMSCs 组与无IFN-γ 培养hAMSCs 组比较,hAMSCs 凋亡水平没有差异(P=0.78)(图3)。
2.4 IFN-γ 对hAMSCs 细胞因子分泌水平的影响 10 ng/mL 至100 ng/mL 浓 度 培养hAMSCs 时sHLA-G 水平均明显升高(P<0.001)(图4A);10 ng/mL IFN-γ 组和无IFN-γ 组相比PEG-2 分泌水平无差别(P=0.068),30 ng/mL IFN-γ、50 ng/mL IFNγ 和无IFN-γ 组相比PEG-2 分泌水平升高(P<0.05),70 ng/mL IFN-γ、100 ng/mL IFN-γ 和无IFN-γ组相比PEG-2 分泌水平升高(P<0.01)(图4B);10 ng/mL 至100 ng/mL 浓度培养hAMSCs 时上清中KYN 水平均明显升高(P<0.001),提示IDO 酶活性较无IFN-γ 组明显增强(图4C)。
图3 100 ng/mL IFN-γ 对hAMSCs 的凋亡影响Fig3 Apoptosis of hAMSCs stimulated with 100 ng/mL IFN-γ
图4 IFN-γ 对hAMSCs 炎性因子分泌水平的影响Fig4 Effect of IFN-γ on the level of inflammatory factors secreted by hAMSCs
50年前IFN-γ 作为病毒抑制蛋白首次被Frederick Wheelock 发现,由NKs、Th1、细胞毒CD8+T 细胞、巨噬细胞等分泌的重要促炎症因子,在炎症性疾病如GVHD 的起始、发生、发展中起到重要作用[1-2]。IFN-γ在临床上用来抗病毒、抗肿瘤,目前越来越多的研究发现IFN-γ具有免疫调节作用。IFN-γ能够通过IDO 代谢途径对免疫细胞及MSC 等发挥直接或间接免疫激活、免疫抑制或诱导免疫耐受作用。MSCs 发挥免疫调节作用需要炎症环境中IFN-γ的激活。IFN-γ激活的BMMSCs 分泌及免疫调节能力增强,有效防治GVHD,且随着IFN-γ浓度增加BMMSCs 的免疫抑制作用增强[3-5]。本研究结果中,未经IFN-γ处理的hAMSCs 具有弱IDO酶活性,分泌低水平细胞因子PGE-2、sHLA-G,经IFN-γ处理的hAMSCs 分泌PGE-2、sHLA-G 水平提高,IDO 酶活性增强,随着IFN-γ浓度的增加,hAMSCs 的IDO 酶活性及分泌PGE-2、sHLA-G 分泌功能增强,表明IFN-γ的刺激能增强hAMSCs 的免疫调节能力。IFN-γ激活的MSCs 能上调MSCs 表面B7-H1 表达,通过STAT-1 信号通路影响MSCs 的免疫抑制功能,在MSCs 的免疫调节中发挥重要的协同作用[10],但IFN-γ增强hAMSCs 免疫调节功能的机制仍需进一步研究。
hAMSCs 来源于胎盘羊膜,易于获得,数量丰富,具有MSCs 的生物学特征,低免疫源性及免疫调节作用,已经用于再生医学领域及自身免疫疾病[9,11-12]。hAMSCs 可通过分泌可溶性因子发挥固有性和适应性免疫调节作用。hAMSCs 可通过IDO酶、sHLA-G、白介素-10(interleukin-10,IL-10)、TGF-β1、PGE-2 等炎性介质调节CD4+/CD8+T 细胞,诱导免疫耐受作用,调节成熟树突状细胞(mature dendritic cells,mDCs)转变成耐受性树突状细胞(tolerated dendritic cells,tDCs),进一步通过sHLA-G 诱导产生免疫抑制性调节性T 细胞(regulatory T cells,Tregs)。本实验中结果表明,hAMSCs 具有IDO 酶活性,分泌sHLA-G、PGE-2 细胞因子的能力,但IFN-γ激活后的hAMSCs 对免疫细胞的调节作用仍待研究。研究表明,IFN-γ不影响人脐带间充质干细胞(human umbilical cordderived mesenchymal stromal cells,hUC-MSCs)的增殖能力。与既往报道一致,本研究中不同浓度IFN-γ组中hAMSCs 的增殖能力无明显变化,100 ng/mL IFN-γ组hAMSCs 无凋亡情况,结果表明IFN-γ不影响hAMSCs 的增殖,不诱导hAMSCs 凋亡。
综上所述,hAMSCs 不仅能用于再生医学领域中,越来越多的研究聚焦在其免疫调节作用,尤其关注对GVHD 的临床应用。本实验研究结果表明促炎症因子IFN-γ 在不影响hAMSCs 生长、增殖的情况下,能够提高PGE-2、sHLA-G 的分泌水平,增强IDO 酶活性,IFN-γ 在hAMSCs 微环境中可以发挥重要的免疫调节作用,为hAMSCs 防治GVHD 提供理论依据。