miR-21在非小细胞肺癌组织细胞中的表达变化及其在细胞增殖、凋亡中的作用

金文静，顾文超，袁亚平，冯慧丽，王冬冬

(1 上海健康医学院附属浦东新区人民医院，上海201200；2 上海市浦东医院 复旦大学附属浦东医院)

非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的常见类型，包括鳞癌、腺癌和大细胞肺癌。临床上肺癌的治疗多采用以手术为主，以放化疗、生物治疗、中药治疗等为辅的综合治疗，但其5年生存率仍较低[1，2]。微小核糖核酸(microRNA)是一类相对分子质量较小的非编码RNA，因其不能编码蛋白，曾被认为是基因组中的“废料”或“垃圾”。近年研究发现，microRNA可调控多种基因的表达与功能，从而参与细胞的多种生物学过程[3]。microRNA-21(miR-21)定位于人类染色体17q23.2上，在多种恶性肿瘤的发生发展中具有促进作用，被认为是一种促癌基因[4，5]。目前，有关miR-21在NSCLC发病中的作用尚不明确，研究结果也存在一定差异。因此，本研究采用荧光定量PCR法检测了miR-21在肺癌组织细胞中的表达变化，并观察了抑制miR-21表达后肺癌细胞、增殖凋亡等生物学特性的变化，旨在探讨其在NSCLC发病中的作用，为肺癌的诊断与治疗提供新的标志物和靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本和细胞 收集上海浦东新区人民医院2017年1月1日～2018年12月31日收治56例NSCLC患者，选取其手术后存档的病理组织标本。患者术前均未行放疗、化疗及生物治疗等抗肿瘤治疗，术中留取肺癌组织及癌旁组织(距离癌组织≥5 cm)，术后均经病理学检查确诊。56例NSCLC患者中，男37例、女19例，年龄38～72岁，病理类型为鳞癌40例、腺癌16例，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期38例、Ⅲ～Ⅳ期18例，组织分化程度为高分化20例、中分化25例、低分化11例，发生淋巴结转移19例。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。人NSCLC细胞A549、人正常肺上皮细胞BEAS-2B均购自中国医学科学院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂和仪器 RPMI1640培养基购于美国Hyclone公司，胰蛋白酶购于上海生物工程有限公司，胎牛血清(FBS)购于杭州四季青生物有限公司；mRNA提取试剂盒购于美国Invitrogen公司，TRIzol Reagent、UItraSYBR Mixture均购于北京康为世纪生物科技公司，Rever Tra Ace qPCR RT Kit购于立陶宛MBI Fermentas公司，miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit购于南京诺唯赞生物科技有限公司；引物序列：miR-21上游引物为5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′、下游引物为5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′，内参照U6上游引物为5′-CAGCACATATACTAAAATTGGAACG-3′、下游引物为5′-ACGAATTTGCGTGTCATCC-3′，均由上海吉玛公司设计并合成；LipofectamineTM2000购于美国Invitrogen公司，抑表达miR-21的反义序列(miR-21 inhibitors：5′-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGU-3′)、无义序列(miR-21-NC：5′-GUCAACAUCAUCAGUCUGAUAAG-CUA-3′)由上海生工生物有限公司设计并合成；MTT检测试剂盒购于美国Millipore 公司，流式细胞仪购于美国Becton Dickinson公司。

1.2 实验方法

1.2.1 组织标本处理 取冻存的组织标本约50 mg，粉碎后按mRNA提取试剂盒说明书提取组织总mRNA。采用分光仪测定mRNA浓度，按照浓度稀释配比后使用逆转录试剂盒逆转录。

1.2.2 细胞培养 将A549、BEAS-2B细胞接种于含10% FBS、谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素/链霉素各100 U/mL的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2、100%湿度的细胞培养箱中培养。当细胞融合度≥90%时，用胰蛋白酶消化细胞，以1 000 r/min离心10 min后，去除酶消化液；用PBS重悬细胞后，再次离心后加细胞生长液。将细胞接种于细胞培养板中，置于37 ℃、5% CO2、100%湿度的细胞培养箱中继续培养。

1.2.3 组织和细胞中miR-21检测 采用荧光定量PCR法。收集培养24 h的A549、BEAS-2B细胞以及处理后的NSCLC组织和癌旁组织，以荧光定量PCR法检测miR-21表达。用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA，按照UltraSYBR Mixture PCR反应体系进行扩增。反应条件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，53 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共进行40个循环。以U6为内参照，采用2-ΔΔCt法计算miR-21相对表达量。

1.2.4 肺癌细胞分组与转染 取对数生长期的A549细胞，用PBS调整细胞密度为4×104/mL,以1 mL/孔接种于24孔细胞培养板；细胞呈对数生长期后，将细胞分为抑制组、无义组和对照组。抑制组、无义组分别按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书转染miR-21 inhibitors、miR-21-NC，对照组不予转染。将细胞继续培养6 h 后，更换为含10% FBS的RPMI1640培养基，置于37 ℃、5% CO2、100%湿度细胞培养箱中继续培养24 h。

1.2.5 细胞增殖情况观察 采用MTT法。收集各组对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化；完全培养基重悬后，以1.5×103/孔接种于96孔板，每组设6个复孔，共接种5张；置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养5 d，从接种后第2天至培养终止前4 h，每孔加入浓度为5 g/L的MTT 10 μL，继续培养4 h。去除培养液，每孔加二甲基亚砜100 μL终止反应，检测波长为490 nm时的光密度(OD)。细胞增殖率=(OD实验孔-OD对照孔)/OD对照孔×100%。

1.2.6 细胞凋亡情况观察 采用流式细胞仪。取各组对数生长期细胞，加胰蛋白酶消化，用PBS调整细胞密度为2×106/mL。吸取细胞悬液1 mL置于离心管中，4 ℃下以1 000 r/min离心10 min，去除上清；加入预冷的PBS 1 mL 重悬细胞，离心后吸弃上清，PBS洗1次；加入Binding Buffer 200 μL 重悬细胞，加入PI和Annexin-V后充分混匀，避光室温静置20 min；加300 μL缓冲液，上流式细胞仪检测凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

2 结果

2.1 NSCLC和癌旁组织中miR-21表达比较 NSCLC组织中miR-21表达量为2.98±0.99，高于癌旁组织中的1.04±0.32(P<0.01)。

2.2 A549、BEAS-2B细胞中miR-21表达比较 A549细胞中miR-21表达量为3.41±1.03，高于BEAS-2B细胞中的0.94±0.29(P<0.01)。

2.3 不同临床病理特征NSCLC组织中miR-21表达比较 见表1。

2.4 各组A549细胞增殖率比较 抑制组、无义组、对照组细胞增殖率分别为74.32%±5.67%、95.81%±3.45%、96.43%±3.83%，抑制组细胞增殖率低于无义组和对照组(P均<0.05)，无义组和对照组间细胞增殖率比较差异无统计学意义(P﹥0.05)。

表1 不同临床病理特征NSCLC组织中miR-21表达比较

2.5 各组A549细胞凋亡率比较 抑制组、无义组、对照组细胞增殖率分别为32.18%±5.21%、4.56%±2.19%、4.26±1.98%，抑制组细胞凋亡率高于无义组和对照组(P均<0.05)，无义组和对照组间细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P﹥0.05)。

3 讨论

肺癌的发生与发展受多因子、多因素、多阶段的控制，其中癌基因的激活和抑癌基因的失活或丢失是其发生的重要原因[6]。局部和远处的转移是NSCLC治疗中的常见临床问题，也是导致患者预后不良的最主要原因[7～9]。手术切除是目前NSCLC最主要的治疗方法，针对多种目的基因进行靶向治疗也能提高其治疗效果[10]。但是，由于NSCLC的早期临床症状多不明显，确诊时多已处于晚期，往往错失手术治疗的最佳时机。因此，寻找新的肿瘤标志物以及治疗靶点，对于早期诊治NSCLC具有重要意义。

microRNA是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码单链小RNA，由细胞内源产生的发夹结构转录本加工而成。其主要与靶基因3′非编码区(UTR)结合，通过在翻译水平抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达与功能，在细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程中发挥重要作用，其表达异常参也与了肿瘤、动脉粥样硬化等病理过程[11，12]。miR-21是microRNA家族重要的组成成员之一，由72个核苷酸茎环结构前体剪切加工而成。研究发现，其基因高度保守，位于蛋白质基因间隔，具备自主转录单位。与大多数microRNA不同，miR-21具有自己相对独立的启动子，其表达不受重叠蛋白编码基因启动子的调控，因此其在基因表达调节中可能起重要作用。miR-21广泛表达于T细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞及树突状细胞等免疫细胞，也可少量表达于造血细胞[13]。近年来，随着对miR-21研究的深入，发现其在结肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤组织中表达上调。本研究采用荧光定量PCR法检测发现，NSCLC组织中miR-21的表达量高于癌旁组织，人NSCLC细胞A549中miR-21的表达量高于人正常肺上皮细胞BEAS-2B。这与以往研究[14，15]结果一致，提示miR-21可能在NSCLC的发病过程中具有促癌作用。本研究还发现，NSCLC组织中miR-21表达与患者的性别、年龄、病理类型及分化程度关系不大，差异均无统计学意义；而与TNM分期及淋巴结转移有关，且TNM分期越低、有淋巴结转移患者NSCLC组织中miR-21表达更高。因此，miR-21可作为诊断肺癌的肿瘤标志物和治疗靶点进行深入研究。

为进一步明确miR-21在NSCLC发生发展中的作用，我们通过设计基因干扰序列以降低miR-21表达。结果发现，与无义组和对照组比较，抑制组细胞增殖率降低、细胞凋亡率升高；无义组和对照组之间细胞增殖率、细胞凋亡率差异无统计学意义。因此，miR-21在NSCLC的发生中发挥重要作用，同时也为临床治疗NSCLC提供了可靠的分子靶点。研究发现，miR-21表达受多种细胞内外信号分子的调控，如全反式维甲酸、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、脂多糖、白细胞介素4等可上调其表达；此外，在某些特定的细胞类型中，DNA甲基化修饰亦参与miR-21的表达调控。有研究显示，卵巢癌OVCAR3细胞经DNA甲基化酶抑制剂处理后，细胞高表达miR-21[16]。因此，免疫监控失调以及各种炎性感染在NSCLC的发生中具有重要作用，应在提高患者免疫力的同时减少感染的发生。microRNA与靶基因3′UTR位点的结合无需完全配对，因此一个microRNA可调控多个靶基因。miR-21作为一种促癌microRNA，可通过调节下游多个抑癌基因以促进肺癌的发生与发展。另外，研究还发现，miR-21可通过靶向调控PTEN、PI3K、PDCD4、BTG2、FasL、TIMP3等多种基因表达，促进细胞增殖以诱发肿瘤；通过靶向调控PTEN、TIMP1和TIMP3等基因表达，促进新生血管形成、提高细胞的侵袭迁移能力，从而导致肿瘤的生长与转移[17，18]。

综上所述，在NSCLC组织和细胞中miR-21高表达，降低其表达可以抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。miR-21在NSCLC的发病中具有重要作用，有望作为早期诊断肺癌及临床治疗的重要分子靶点。