Gli1抑制剂GANT61对髓母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响

卢恩敏，卢恩娟，高丽京，裴立静，王庆艳，师翠云

(1唐山市丰润区人民医院，河北唐山064000；2唐山市丰润区第二人民医院)

SHH信号通路在机体小脑细胞的发育过程中发挥重要作用，该信号通路由SHH配体蛋白Sonic Hedgehog、转录因子Gli、跨膜蛋白受体Ptch、跨膜蛋白Smo组成[1]。Gli1是SHH信号通路下游终末端的转录因子，调控下游Bcl-2、Cyclin D1、myc等多个靶基因[2～4]。目前研究表明，Gli1和Bcl-2在髓母细胞瘤组织中呈高表达，与淋巴结转移、组织学分化、病理类型有一定的相关性。Gli1异常激活可促进Bcl-2转录活化，从而导致通路持续激活，细胞过度增殖，促进髓母细胞瘤形成[5]。SHH信号通路是影响恶性肿瘤细胞增殖和凋亡的重要影响通路，GANT61是SHH信号通路下游的Gli1抑制剂，可抑制SHH信号通路的激活，也是研究髓母细胞瘤细胞作用机制的重要抑制剂[6]。2017年8月～2019年1月，我们观察了GANT61调控Gli1和Bcl-2蛋白表达水平对髓母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响，分析髓母细胞瘤发生发展中Gli1和Bcl-2的表达情况及GANT61的作用，旨在为髓母细胞瘤提供有效的治疗靶点和治疗依据。

1 材料与方法

1.1 材料 髓母细胞瘤Daoy细胞，购自中国医学科学院基础医学研究所。GANT61、RPMI1640培养基购自英国Abcam公司，PCR引物、PCR试剂盒由日本Takara公司提供，Gli1兔多克隆抗体、Bcl-2鼠单克隆抗体、GAPDH鼠单克隆抗体购自英国Abcam公司。CO2培养箱购自上海姚氏仪器培养箱设备厂，流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 细胞培养与分组处理 将Daoy细胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞生长到70%～80%时，按1∶2～1∶4进行传代培养。将细胞分为对照组和10、50、100 μmol/L GANT61组，对照组加入0.1% DMSO，10、50、100 μmol/L GANT61组分别加入10、50、100 μmol/L GANT61和0.1% DMSO，均培养24 h。

1.3 细胞增殖抑制率检测 采用MTT法。收集各组对数生长期细胞，按5×103/孔接种于96孔板，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL继续培养4 h。加入DMSO 200 μL充分溶解细胞内结晶，上酶标仪于570 nm处检测个孔吸光度(OD)，以OD570表示细胞增殖情况。增殖抑制率=(对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。

1.4 细胞凋亡指数检测 采用流式细胞术。收集各组对数生长期细胞，加入6孔板中。加入胰酶消化，结合缓冲液洗涤，离心去上清。加入结合缓冲液重悬细胞，加入FITC Annexin Ⅴ和PI混匀，避光孵育20 min。1 000 r/min离心5 min，去上清，结合缓冲液洗涤。1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡指数。

1.5 细胞周期检测 采用流式细胞术。收集各组对数生长期细胞，离心去上清，PBS清洗重悬细胞后加入1 mg/mL RNaseA 2 μL，37 ℃水浴40 min。将10 μL FITC Annexin Ⅴ和5 μL PI加入200 μL孵育缓冲液中混匀，配成1 μg/mL的标记液。滴加100 μL标记液重悬细胞，室温避光孵育20 min。离心去上清，上流式细胞仪检测各周期细胞所占比例。

1.6 细胞中Gli1、Bcl-2 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。使用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列：Gli1上游5′-GGTTCCCAGGTTAGCCCAAG-3′，下游5′-GGTTCCCAGGTTAGCCCAAG-3′；Bcl-2上游5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′，下游5′-TGCATATTGTTTGGGGCAGG-3′；GAPDH上游5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3′，下游5′-TGGACTCCACGACGTACTCA-3′。反应条件：97 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。以GAPDH为内参照，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.7 细胞中Gli1、Bcl-2蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集各组对数生长期细胞，加入裂解液，离心收集上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。上样SDS-PAGE胶，加入1∶1 000的Gli1、Bcl-2、GAPDH单抗过夜，TBST洗涤。加入1∶5 000的辣根过氧化物酶标记的二抗IgG室温孵育1 h，TBST洗涤。将膜置于Imaging System化学发光成像系统进行自动曝光，以目的蛋白与内参蛋白GAPDH的灰度值之比表示目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 对照组和10、50、100 μmol/L GANT61组的细胞增殖抑制率分别为0.43%±0.04%、19.33%±7.17%、34.20%±7.22%、45.20%±5.69%。各浓度GANT61组细胞增殖抑制率均高于对照组，且50、100 μmol/L GANT61组高于10 μmol/L GANT61组，100 μmol/L GANT61组高于50 μmol/L GANT61组(P均<0.05)。

2.2 各组细胞凋亡指数比较 对照组和10、50、100 μmol/L GANT61组的细胞凋亡指数分别为3.09%±0.15%、10.79%±0.34%、22.67%±0.55%、31.30%±0.99%。各浓度GANT61组细胞凋亡指数均高于对照组，且50、100 μmol/L GANT61组高于10 μmol/L GANT61组，100 μmol/L GANT61组高于50 μmol/L GANT61组(P均<0.05)。

2.3 各组细胞周期比较 各浓度GANT61组G1期细胞比例均高于对照组、S期细胞比例均低于对照组，且50、100 μmol/L GANT61组G1期细胞比例高于10 μmol/L GANT61组、S期细胞比例低于10 μmol/L GANT61组，100 μmol/L GANT61组G1期细胞比例高于50 μmol/L GANT61组、S期细胞比例低于50 μmol/L GANT61组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞周期比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与10 μmol/L GANT61组比较，#P<0.05；与50 μmol/L GANT61组比较，△P<0.05。

2.4 各组细胞中Gli1、Bcl-2 mRNA和蛋白表达比较 各浓度GANT61组Gli1、Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组，且50、100 μmol/L GANT61组低于10 μmol/L GANT61组，100 μmol/L GANT61组低于50 μmol/L GANT61组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组细胞中Gli1、Bcl-2 mRNA和蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与10 μmol/L GANT61组比较，#P<0.05；与50 μmol/L GANT61组比较，△P<0.05。

3 讨论

髓母细胞瘤为原始神经外胚层肿瘤，是最常见的儿童颅内恶性肿瘤之一，多见于10岁以下儿童。髓母细胞瘤的发病机制复杂，涉及到多基因、多信号通路。SHH信号通路是髓母细胞瘤发病机制中常见的通路之一，该通路过度激活可导致髓母细胞瘤细胞异常增殖，进而形成肿瘤[7]。Gli1是SHH信号通路下游终末端的转录因子，正常情况下，Ptch跨膜蛋白抑制Smo跨膜蛋白活性，当出现Smo跨膜蛋白异常激活，可促进转录因子Gli活化。Gli蛋白家族存在于细胞核和细胞质中，是大分子量C2H2型锌指结构蛋白，将信号传送至核内，从而启动下游靶基因的转录，引起SHH信号通路持续激活，导致细胞增殖异常[8]。Gli1是SHH信号通路的激动子，Gli1异常活化是肿瘤细胞增殖生长的重要条件[9]。本研究结果显示，不同浓度GANT61组细胞增殖抑制率高于对照组，且随着GANT61浓度升高，细胞增殖抑制率与凋亡指数也随之升高，表明GANT61能够抑制髓母细胞瘤细胞增殖并促进髓母细胞瘤细胞凋亡。

Gli1表达水平的高低能反映SHH信号通路激活程度[10]。Gli1异常激活可以促进下游周期蛋白Cyclin D1靶基因转录活化，抑制Gli1表达能够抑制Cyclin D1过度表达，并且抑制肿瘤细胞的增殖生长，促进肿瘤细胞凋亡[11]。本研究显示，不同浓度GANT61组G1期细胞比例高于对照组，随着GANT61浓度升高，细胞G1期细胞比例逐渐升高，S期细胞比例逐渐降低，表明GANT61可以引起髓母细胞瘤细胞株G1期阻滞而影响细胞周期。相关研究表明，GANT61能够阻滞髓母细胞瘤细胞周期G1/S期调控位点，S期及G2/M期细胞显著减少，G1期细胞数量显著增多，从而阻滞细胞周期，促进细胞凋亡[12]。也有研究表明，Gli1的异常激活能够调控下游Cyclin D1高表达，GANT61能够对Gli1下游基因Cyclin D1进行转录表达调控[13]。

Bcl-2基因是位于Gli1下游的一种抑制细胞凋亡的原癌基因，为线粒体膜的整合蛋白，主要存在于线粒体、内质网和核膜上[14]。Bcl-2转录表达受Gli1调控。在髓母细胞瘤细胞中，由于存在Gli1的高表达，可导致相应的Bcl-2启动子依赖因子活跃[15]。高表达的Bcl-2能通过改变线粒体膜通透性来抑制Caspase活化，达到抑制细胞凋亡的作用[16]。本研究结果显示，不同浓度GANT61组的Gli1、Bcl-2 mRNA和蛋白表达量均低于对照组，随着GANT61浓度升高，Gli1、Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平随之降低，表明GANT61能够抑制髓母细胞瘤细胞Bcl-2 mRNA和蛋白表达。

综上所述，GANT61能够抑制髓母细胞瘤细胞的Gli1和Bcl-2基因及蛋白表达，从而抑制细胞增殖，增加G1期细胞比例，促进细胞凋亡。