过表达Homer1a对神经元机械性损伤模型的保护作用及可能机制*

王 远, 何主强, 罗 明, 黄从刚, 宋 平, 王孟阳, 段发亮

(武汉市第一医院神经外科, 湖北 武汉 430022)

创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)是一类具有高致残率和致死率的疾病，TBI之后的继发性脑损伤引起的神经炎症及氧自由基等可促进caspase依赖的细胞凋亡，导致大量神经元细胞凋亡，最后引起神经功能严重受损[1-3]，因此，减少凋亡所引起的细胞死亡及功能障碍，促进损伤神经元的再生增殖，是目前TBI研究的热点问题。突触后膜骨架蛋白Homer1a是一种存在于中枢神经系统中的信号转导蛋白，参与调控抑郁症和癫痫等多种神经性疾病的发生和发展，是目前研究最为广泛的Homer蛋白[4-6]。研究表明，神经损伤后Homer1a蛋白表达量会发生特异性变化，是一种反映神经损伤的新型敏感指标[7]。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一种主要由神经元合成的丝氨酸/苏氨酸激酶，细胞能量代谢发生障碍可激活AMPK磷酸化，磷酸化的AMPK可通过介导多条信号通路参与神经元修复过程[8-10]。但Homer1a如何通过磷酸化的AMPK对机械性损伤的神经元细胞起到保护作用，其机制目前尚不明确。因此，本研究拟通过体外培养大鼠皮层神经元，构建神经元机械性损伤模型，并采用基因编辑技术过表达Homer1a蛋白水平，初步探讨过表达Homer1a蛋白对神经元机械性损伤模型的保护作用及其对AMPK蛋白表达的影响。

材 料 和 方 法

1 实验材料与试剂

清洁级Sprague-Dawley (SD)大鼠，雌性，孕16～17 d，由湖北省疾控中心提供,合格证号No.42000600029456；皮层神经元从胎鼠大脑皮层提取。DMEM培养液和Neurobasal培养液(Gibco)；兔单克隆Homer1a抗体、兔多克隆cleaved caspase-3抗体、兔单克隆Bax抗体、兔单克隆Bcl-2抗体、兔单克隆AMPKα抗体和兔单克隆磷酸化AMPKα(p-AMPKα)抗体(Abcam)；兔多克隆GAPDH抗体和小鼠抗兔IgG抗体(Bioswamp)；M-MLV反转录试剂盒(Invitrogen)；SYBR Green PCR试剂盒(KAPA Biosystems)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒和RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

2 方法

2.1 大鼠脑皮层神经元的分离培养 取孕16～17 d SD大鼠，常规消毒后腹腔注射戊巴比妥钠(120 mg/kg)进行麻醉后，暴露腹腔，快速取出大鼠子宫置于无菌台上消毒过的培养皿中，分离胎鼠大脑皮层，吸入于预冷的PBS中，仔细去除脑皮层表面脑膜及细小血管组织，PBS清洗1遍后，将脑皮质小心剪碎，逐滴缓慢加入预热至室温的0.1%胰蛋白酶，置于37 ℃培养箱中消化20 min。随后将消化后的组织块转移到含有10%FBS的DMEM培养液中，小心多次吹打细胞成匀浆后离心，去掉上清液，使用含FBS的DMEM重悬细胞沉淀，显微镜下计数，调整细胞浓度，将5×108/L细胞接种至铺有多聚赖氨酸的培养皿中，置于37 ℃、5% CO2恒温恒湿培养箱中培养。24 h后弃去培养液，小心洗涤细胞后，用含有10% B27的Neurobasal培养液培养细胞，每3 d半量换液。培养6～8 d，经细胞鉴定成功后，用于后续实验。

2.2 离体神经元机械性损伤模型的建立 取10 μL的微量移液器塑料枪头在培养皿内划割神经元，横竖各划8道，划伤道宽度约为1 mm，标记线均匀分布在培养皿表面，造成神经元机械性损伤[11]，对神经元细胞进行台盼蓝染色及LDH含量测定，以保证同一组内神经元损伤程度和范围一致。

2.3 实验分组 待神经元培养成功后，以每孔5×104的密度将神经元接种至24孔培养板，待细胞生长融合度达70%左右时，采用Homer1a过表达慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen1-expHomer1a，购于上海汉恒生物科技有限公司，下文记作Exp-Homer1a)及相应的空载体按照感染复数为20进行细胞感染，置于培养箱中培养，24 h后更换培养液，继续培养24～48 h备用。本实验分为4组，分别为对照(control)组、模型(model)组、空载(empty vector)组和Exp-Homer1a组。对照组为正常神经元;模型组按照上述方法构建神经元机械性损伤模型;空载组和Exp-Homer1a组是在神经元机械性损伤模型中转载空载体和Homer1a过表达慢病毒载体。

2.4 qPCR检测Hormer1a mRNA表达水平 收集各组细胞沉淀，TRIzol法提取各组神经元总RNA，根据M-MLV反转录试剂盒说明书反转录成cDNA。随后以cDNA作为模板，采用SYBR Green PCR试剂盒进行Real-time PCR扩增反应。Hormer1a上游引物序列为5’-CACCCGATGTGACACAGAACTC-3’，下游引物序列为5’-TGATTGCTGAATTGAATGTGTACCT-3’。GAPDH上游引物序列为5’-CAAGTTCAACGGCACAG-3’，下游引物序列为5’-CCAGTAGACTCCACGACAT-3’。以GAPDH作为内参照，采用2-ΔΔCt方法计算各组之间Hormer1a的表达差异。

2.5 MTT检测细胞增殖活性 将各组细胞置于96孔板内，每孔加入终浓度为0.5 g/L MTT溶液，继续培养4 h。小心吸出培养液，每孔加入750 μL DMSO，低速震荡摇床中混匀10 min，然后取出150 μL溶液置于96孔板内，采用酶标仪测定490 nm处光吸光度(A)，计算各组细胞相对活力，细胞相对活力(%)=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。

2.6 LDH活性检测 各组细胞处理结束后，留取各组培养液上清，依据LDH检测试剂盒说明书测定各组细胞培养上清中LDH活性。

2.7 流式细胞术检测凋亡 收集各组细胞的培养液上清，采用0.2%胰蛋白酶(不含EDTA)消化处理制备单细胞悬液，与培养液上清一起收集至15 mL离心管内。200×g室温离心5 min，去除上清，采用预冷的PBS清洗细胞2次，弃去上清。加入适量Annexin V-FITC结合液重悬细胞，各取100 μL细胞悬液置于1.5 mL离心管中，依次加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染液，设置单染管和双染管，轻轻混匀后置于25℃水浴中避光孵育15 min。然后加入适量Annexin V-FITC结合液，混匀后置于冰上终止反应。直接采用流式细胞仪检测荧光信号。

2.8 Western blot检测Hormer1a、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2和p-AMPK蛋白表达 收集各组细胞沉淀，加入适量RIPA蛋白裂解液提取神经元总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。每孔上样20 μg蛋白，经12% SDS-PAGE后，采用湿转法将分离蛋白转移至PVDF膜上，置于5%脱脂牛奶(TBST配制)中室温封闭1.5 h；TBST洗膜后将膜放入自封袋中，分别加入抗Homer1a、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p-AMPK、AMPK以及GAPDH抗体的稀释液，于4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后加入小鼠抗兔IgG抗体稀释液，室温孵育1.5 h。TBST洗膜3次，HRP显色液显色，全自动化学发光分析仪检测。使用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，将目的蛋白灰度值与GAPDH蛋白灰度值的比值以及p-AMPK蛋白灰度值与AMPK蛋白灰度值的比值作为各目的蛋白相对表达量。

3 统计学处理

采用统计学软件SPSS 22.0进行数据分析，实验数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 各组神经元Homer1a表达

采用qPCR和Western blot分别检测各组神经元中Homer1a的表达，结果显示，模型组神经元中Homer1a的mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组神经元(P<0.05)；Exp-Homer1a组神经元中Homer1a的mRNA和蛋白表达水平均显著高于模型组和空载组神经元(P<0.05)，见图1、2，表明神经元转染过表达Homer1a载体成功，可用于后续实验。

Figure 1. Relative protein expression of Homer1a was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图1 各组神经元Homer1a的蛋白表达

2 过表达Homer1a可提高机械性损伤神经元的活力

过表达Homer1a后，MTT检测各组细胞活力，结果显示，与对照组相比，模型组神经元活力显著降低(P<0.05)；与模型组相比，Exp-Homer1a组神经元活力显著升高(P<0.05)，空载组与模型组神经元活力之间的差异无统计学意义，见图3。

3 过表达Homer1a可降低机械性损伤神经元上清液的LDH活性

LDH活性检测结果显示，与对照组相比，模型组LDH活性显著升高(P<0.05)；与模型组相比，Exp-Homer1a组LDH活性明显降低(P<0.05)，见图4。

Figure 2. Relative mRNA expression of Homer1a was detected by qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图2 各组神经元Homer1a的mRNA表达

Figure 3. The neuronal viability was detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图3 MTT检测各组神经元活力

4 过表达Homer1a可降低机械性损伤神经元的凋亡率

在神经元机械性损伤模型中过表达Homer1a后，流式细胞术检测各组神经元凋亡情况以及Wes-tern blot检测各组神经元凋亡相关蛋白的表达，结果显示，与对照组比较，模型组神经元中cleaved caspase-3和Bax的表达水平显著升高(P<0.05)，Bcl-2的表达水平显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与模型组比较，Exp-Homer1a组神经元中cleaved caspase-3和Bax的表达水平明显降低(P<0.05)，Bcl-2的表达水平显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05),见图5。

Figure 4. LDH activity in the supernatant of neurons. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图4 各组神经元上清液中LDH活性

5 过表达Homer1a可促进机械性损伤神经元中AMPKα蛋白的表达

与对照组比较，模型组p-AMPKα表达水平升高；与模型组比较，Exp-Homer1a组p-AMPKα表达水平显著升高(P<0.05)，见图6。

讨 论

在哺乳动物中，Homer蛋白家族由Homer1、Homer2和Homer3三种亚型及其剪切体组成，属于突触后致密物质家族的重要成员，主要分布在中枢神经系统中，参与神经元多种生理病理过程[12]。当神经元兴奋性增强时，Homer1a的表达迅速上升，可调控突触功能[13]。研究表明，过表达Homer1a可增强大鼠海马的突触传递及细胞内Ca2+内流[14]。在重型颅脑损伤大鼠脑组织海马区，Homer1a表达显著增加，且在损伤6 h后出现最高峰[15]。本研究结果表明，机械性损伤的神经元中Homer1a的mRNA和蛋白表达水平均显著高于正常神经元，且过表达Homer1a可激活AMPKα的磷酸化，提高机械性损伤神经元存活率。

LDH是参与机体能量代谢的一种重要的酶，广泛存在于各种组织器官细胞的胞质中，细胞受损后LDH被释放到胞外。研究表明神经系统损伤后，脑脊液中LDH水平升高，与神经系统损伤程度呈正相关，因此，LDH释放能精确地反映神经元损伤状况[16]。神经元损伤时细胞能量代谢障碍、氧自由基释放增多会促进细胞中促凋亡因子Bax和Bad等的释放，抑制抑凋亡因子Bcl-2的释放，激活线粒体凋亡通路，最终使caspase-3切割活化，导致细胞凋亡[17]。本研究表明，过表达Homer1a能显著降低机械性损伤神经元中LDH活性，降低cleaved caspase-3和Bax的表达水平，升高Bcl-2的表达水平，有效抑制神经元凋亡。AMPK在机体正常生理状态下无活性，而当机体出现能量代谢障碍时，AMPK的α亚单位中的第485位丝氨酸、第172和258位苏氨酸等均可发生磷酸化，其中第172位苏氨酸及其磷酸化对AMPK活性和功能的调节起重要作用[18]。电针预处理可使脑缺血再灌注小鼠海马中p-AMPKα的表达升高，可通过抑制细胞氧自由基的产生及Bax合成，增加细胞超氧化物歧化酶生成，增强细胞抗氧化能力，从而清除氧自由基，减少海马神经元细胞的凋亡[19]。本研究结果显示过表达Homer1a可升高机械性损伤神经元中p-AMPKα的表达，提示过表达Homer1a对机械性损伤神经元的保护作用与促进AMPKα磷酸化的激活有关。

Figure 5. Effect of over-expression of Homer1a on neuronal apoptosis induced by mechanical injury. A： the protein levels of cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 were detected by Western blot; B: the apoptotic rate of each group was detected by flow cytornetry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图5 过表达Homer1a对机械性损伤诱导神经元凋亡的影响

Figure 6. The effect of over-expression of Homer1a on p-AMPKα protein level. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图6 过表达Homer1a对机械性损伤神经元p-AMPKα表达的影响

综上所述，过表达Homer1a对机械性损伤神经元的保护作用，可能与通过促进AMPKα磷酸化，减少cleared caspase-3及Bax的表达，降低神经元LDH的活性有关。