自噬抑制剂巴弗洛霉素A1对巨噬细胞极化的影响*

王 帆， 王 豪▲， 宋雪斌， 孙慧珍， 光姣娜， 南文滨△， 张其清,2△

(1 新乡医学院生命科学技术学院,生命科学与健康研究院， 河南 新乡 453003； 2中国医学科学院生物医学工程研究所， 天津 300000)

糖尿病足是一种典型的慢性皮肤损伤，其临床特征是创面长期不愈合、皮肤组织感染、缺损或坏死，无法经过常规修复过程而及时修复。创面局部炎症反应是高血糖慢性皮肤损伤难愈合的主要原因之一[1-2]。巨噬细胞作为先天免疫系统的重要组成部分，在维持机体炎症反应中发挥不可替代的作用，除了在炎症期清除坏死组织外，还可以通过释放一些炎症因子来调节创面修复[3]。

巨噬细胞可以通过2种不同的方式来调节创面愈合，即经典巨噬细胞活化(M1极化)和替代性巨噬细胞活化(M2极化)。在机体炎症期时，巨噬细胞趋向于M1极化，分泌白细胞介素(interleukin, IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等促炎性细胞因子；当机体炎症消散时，巨噬细胞趋向于M2极化，分泌IL-10和IL-13等抑炎性细胞因子，极化的变化过程影响了创面愈合过程中的炎症反应[4]。研究影响巨噬细胞极化的因素，调控巨噬细胞极化过程，无疑是解决难愈创面炎症失衡问题的有效途径。自噬是一种高度保守的细胞内降解途径，细胞通过溶酶体系统对胞内集聚的蛋白质和受损细胞器进行降解，从而使细胞维持自身稳态。自噬是细胞应对各种危险刺激时的保护机制[5-6]，近期多项研究表明其在调控机体炎症水平方面发挥举足轻重的作用[7]，然而自噬是否通过影响巨噬细胞极化过程，进而影响机体炎症水平，亟待验证。本研究以此为切入点，用自噬下游抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1，Baf A1)干预巨噬细胞，观察其对RAW264.7细胞极化的影响，同时用自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin，Rapa)以及巨噬细胞M1极化激活剂脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)处理细胞，观察细胞自噬情况，探讨Baf A1影响巨噬细胞极化的机制。

材 料 和 方 法

1 细胞与材料

1.1 细胞培养与实验分组 鼠源RAW264.7巨噬细胞购自ATCC，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM高糖培养液在 37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。细胞随机分为如下4组：正常对照(control)组：培养液中常规培养；LPS组：培养液中LPS浓度100 mg/L；Rapa组：培养液中Rapa浓度100 μmol/L；Baf A1组：培养液中Baf A1浓度100 μmol/L。各组于加入药物后12 h对细胞进行后续处理。

1.2 材料与试剂 Baf A1、LPS、Rapa和DMSO均购自Sigma；FITC标记的HLA-DR抗体购自Novus; PE标记的CD197、PE标记的CD36和Alexa Fluor® 647标记的CD206抗体购自BD;磷酸酶抑制剂、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Triton X-100和DAPI均购自碧云天公司；自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和P62抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；GAPDH抗体购自杭州贤至生物有限公司；HRP标记的羊抗兔Ⅱ抗、各细胞因子ELISA试剂盒、浓缩型正常山羊血清和Cy3标记的羊抗兔IgG均购自武汉博士德生物工程有限公司；ECL底物液购自Thermo；抗荧光淬灭封片剂购自Southernbiotech。

2 观察指标及方法

2.1 ELISA测定炎症相关因子的含量 按试剂盒说明书步骤操作，用酶标仪在450 nm处检测吸光度(A)值；采用Originpro 8进行数据分析。

2.2 流式细胞术检测细胞表面相关抗原表达 用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞后，终止消化，离心(500 ×g，4 ℃，5 min)去上清收集细胞，加PBS重悬细胞；离心后用含0.5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS清洗2遍；每流式小管添加I抗，4 ℃孵育30 min；再次离心(500 ×g， 4 ℃，2 min)，PBS清洗2遍；最后用0.5 mL含0.5% BSA的PBS重悬后进行流式细胞仪检测分析。用CD197和HLA-DR双阳性率定量细胞M1极化程度，用CD36和CD206双阳性率定量细胞M2极化程度。

2.3 免疫荧光化学法检测LC3-Ⅱ的表达 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS清洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS清洗玻片3次，每次3 min；0.5% Triton X-100室温通透20 min；PBS清洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸去多余水分，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的LC3-Ⅱ抗体并放入湿盒，4 ℃孵育过夜；PBST清洗爬片3次，每次3 min，吸去多余水分，滴加稀释好的荧光Ⅱ抗(荧光Cy3标记羊抗兔IgG)，于湿盒中37 ℃避光孵育1 h，PBST清洗爬片3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，PBST清洗4次，每次5 min；吸去多余水分，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像，用ImageJ分析处理图像。

2.4 Western blot检测LC3-Ⅱ和P62表达 各组RAW264.7细胞经RIPA处理后，采用BCA蛋白定量法检测各组蛋白浓度，以保证各组样品上样量相同。待测蛋白与5×上样缓冲液按4 1混合，100 ℃变性10 min。每组取蛋白40 mg，进行SDS-PAGE分离，然后电转移至PVDF膜上，再用含5%脱脂奶粉的1×TBST缓冲液在摇床上室温封闭1 h，TBST缓冲液漂洗后，分别加入LC3-Ⅱ、P62和GAPDH的Ⅰ抗(11 000)4 ℃孵育过夜，TBST漂洗PVDF膜3次，每次10 min，封闭液稀释相应的Ⅱ抗(12 000)后，常温下孵育1 h。TBST漂洗PVDF膜3次，每次10 min，ECL发光试剂在曝光仪中进行曝光，以GAPDH为内参照，实验重复3次。采用Image Station 2000R图像工作站采集图像，进行灰度分析。

3 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各处理组细胞相关炎症因子的表达

ELISA结果显示，与control组相比，LPS处理组中促炎细胞因子TNF-α短时间内表达显著升高(P<0.01)，Baf A1处理组4 h后显著升高(P<0.05)，16 h时其表达量与LPS组无显著差异；而Rapa组和control组促炎细胞因子TNF-α表达量无显著差异。各处理组抑炎细胞因子IL-10和IL-13的分泌与control组相比无显著差异，见图1。

2 流式细胞术检测各处理组细胞表面极化相关标志物

结果显示，与对照组相比，LPS处理组和Baf A1处理组巨噬细胞表面CD197和HLA-DR的双阳性率显著升高(P<0.05)，Rapa处理组CD197和HLA-DR双阳性率亦显著升高(P<0.05)；LPS处理组和Baf A1处理组的细胞表面CD36和CD206表达与对照组相比均无显著差异，Rapa处理组CD36和C206双阳性率显著升高(P<0.05)，见图2。

3 免疫荧光化学法检测各处理组细胞LC3-II表达

应用免疫荧光技术检测各处理组自噬小体形成情况，结果显示，Baf A1处理组、Rapa处理组和LPS处理组自噬体形成较对照组显著增多(P<0.05)，见图3。

4 Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白表达的变化

Western blot法检测各组LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白的表达，结果显示，LPS处理组、Rapa处理组和Baf A1处理组与control组相比LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量显著升高(P<0.05)；与control组相比，LPS处理组P62水平显著升高(P<0.05)，Rapa处理组P62水平显著降低(P<0.05)，而Baf A1处理组P62水平无显著改变，见图4。

Figure 1. Effects of different treatments on expression of macrophage polarization related cytokines.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

图1 不同处理对巨噬细胞极化相关细胞因子表达的影响

讨 论

糖尿病足通常在创面表现出持续炎症反应，是一种炎症反应失衡的现象，也是导致创面难愈合的原因之一[8]。巨噬细胞是先天免疫系统的主要组成部分，在不同微环境中功能特性不同，按照其表型和分泌的细胞因子可分为两大类，即经典活化型巨噬细胞(M1型)和替代活化型巨噬细胞(M2型)。由细菌脂多糖和Th1细胞分泌的γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)激活的巨噬细胞被称为经典激活的巨噬细胞，亦称M1型巨噬细胞，主要分泌促炎性细胞因子；由Th2细胞因子激活的巨噬细胞称为替代激活的巨噬细胞，亦称M2型巨噬细胞，分泌抑炎性细胞因子，巨噬细胞在创面愈合过程的不同阶段显示不同的极化特征，在组织损伤修复和重塑中起到重要作用。然而影响巨噬细胞极化的因素有很多，例如在糖尿病患者机体中，晚期糖基化终末产物能够使创面组织炎症反应持续[9]，因此，研究巨噬细胞极化的影响因素，通过药物调控巨噬细胞极化过程来缓解炎症失衡现象，进而促进难愈创面的愈合，是一种有效途径。

Figure 2. Effects of different treatments on the surface polarization characteristics of macrophages. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图2 不同处理对巨噬细胞表面极化特征的影响

细胞自噬是一种高度保守的细胞内降解途径，是细胞在应对各种危险刺激时的一种保护机制，通过降解胞内受损的大分子蛋白或细胞器，可以维持细胞内环境稳态[10-11]。多项研究表明，自噬通路及其相关蛋白能够参与调控免疫应答和调控过度炎症反应。Salminen等[12]的研究发现伴随着衰老过程，自噬功能逐渐减弱，引起炎症小体，尤其是NLPR3的激活增加，说明自噬在炎症小体的激活过程中起到负向调控的作用。然而自噬过程是否通过影响巨噬细胞的极化过程从而参与调控免疫应答，相关的研究尚少。

本研究显示，Baf A1可以阻断自噬流，同时可以诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌大量的促炎细胞因子TNF-α，且细胞表面抗原多表达CD197和HLA-DR等M1极化的特征标志物，该结果与LPS诱导巨噬细胞M1极化的结果相似，同时，结合流式结果，Baf A1处理细胞后，M1极化相关标志物明显增加，故可说明Baf A1确实可以诱导巨噬细胞M1极化。一些相关研究也报道了类似结果，例如，在肥胖小鼠动物实验中，自噬过程异常可导致巨噬细胞M1极化，引起肝脏过度炎症进而导致肝损伤[13]。因此，我们推测，Baf A1抑制自噬过程导致的巨噬细胞M1极化，可能是使难愈创面炎症失衡的原因之一。为进一步明确Baf A1诱导巨噬细胞M1极化的机制，我们用自噬激活剂Rapa、巨噬细胞M1极化诱导剂LPS作为对照，观察各组药物对巨噬细胞自噬小体形成的影响。免疫荧光结果显示：Rapa组、Baf A1组和LPS组在药物干预12 h后，均可观察到巨噬细胞自噬小体的增加。该结果与预期一致，即Rapa作为自噬激活剂，可以增加巨噬细胞自噬小体的形成，而Baf A1是一种囊泡性H+-ATP酶质子泵抑制剂，通过抑制液泡膜V-ATP酶的活性来抑制自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，导致自噬体堆积，然而我们并不能确认LPS处理组自噬小体增多的原因。进一步用Western blot检测各处理组细胞LC3-Ⅱ和P62表达水平，评估各组自噬流变化，结果显示，Rapa组LC3-Ⅱ升高，而P62显著降低，提示自噬流通畅且被激活，结合前面的结果，Rapa处理细胞对巨噬细胞的极化过程，并无规律性促进作用；而对于LPS处理组，LC3-Ⅱ蛋白表达升高，且同时P62大量累积，提示自噬流下游自噬溶酶体的形成被显著抑制，造成大量自噬体累积，该抑制方式与Baf A1类似，结合前面有关Baf A1处理后巨噬细胞的极化特征数据，说明抑制自噬下游自噬溶酶体的形成可以导致巨噬细胞向M1方向极化。

Figure 3. The change of autophagy vesicles in RAW264.7 were detected by immunofluorescence (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图3 免疫荧光化学法检测各处理组细胞自噬的变化

综上所述，本实验初步表明Baf A1作为自噬抑制剂可能参与抑制自噬溶酶体形成，并导致巨噬细胞向M1方向极化。该结论为解释自噬过程调控炎症平衡的机制提供了参考资料。能否通过调控自噬过程来影响巨噬细胞极化，进而调节慢性炎症疾病的炎症失衡现象，仍需进一步探讨。

Figure 4. The changes of autophagy related proteins in each treatment group were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图4 Western blot检测各处理组细胞自噬相关蛋白的变化