IL-17通过抑制miR-195-5p表达促进子宫内膜癌细胞生长和转移*

肖 庆， 刘 莉， 胡雅君， 姜 柳， 李金丽， 邓小艳

(武汉市第一医院生殖医学科， 湖北 武汉 430030)

子宫内膜癌(endometrial carcinoma)是常见的女性生殖系统恶性肿瘤，起源于子宫内膜上皮细胞，好发于绝经期和绝经后的女性，发病率呈逐年上升趋势，是世界第6大妇科恶性肿瘤[1]。据报道，2012年世界子宫内膜癌新发病例约32万，死亡约7万例，其中发达国家发病率较高[2]。子宫内膜癌早期症状明显，经确诊时多数患者病灶局限于子宫内，且生长缓慢，发生转移时间较晚，及早发现并治疗患者预后较好，5年生存率高达80%[3]；而晚期子宫内膜癌约占25%，治疗难度大，虽然手术治疗、放疗和化疗等联合进行能够在延缓疾病发展，但预后较差[4]。白细胞介素17(interleukin-17，IL-17)是主要由辅助性T细胞分泌的促炎因子，与自身免疫性疾病、传染性疾病、癌症等多种疾病的发生发展有关[5-6]。近年来，越来越多的研究表明，IL-17在胃癌和肝癌等多种肿瘤细胞增殖、血管生成及肿瘤转移中起重要作用[7-8]。本研究以人子宫内膜癌HEC-1-B细胞为研究对象，给予IL-17外源性处理，通过MTT和Transwell实验检测IL-17对HEC-1-B细胞活力、迁移和侵袭的影响。

材 料 和 方 法

1 一般资料

选取2016年1月～2018年3月就诊于武汉市第一医院的子宫内膜癌患者和良性子宫病变患者为研究对象：子宫内膜癌36例，年龄42～78岁，均行子宫切除术，术前未接受放、化疗，记为cancer组；良性子宫病变患者36例，年龄33～76岁，记为良性(benign)组。2组患者术前均签署知情同意书。本实验符合医学伦理学要求。

2 材料

人子宫内膜癌HEC-1-B细胞购自中国科学院上海生命科学研究院。胎牛血清、DMEM和胰蛋白酶购自HyClone；TRIzol总RNA提取试剂盒、Lipofectamine 2000转染试剂、control mimics和miR-195-5p mimics购自Invitrogen；Transwell小室购自Corning；MTT和二甲基亚砜购自Sigma；反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自TaKaRa；结晶紫和多聚甲醛购自Solarbio；引物序列由北京六合华大基因科技有限公司合成。NanoDrop微量核酸测定仪购自上海创萌生物科技有限公司；细胞培养箱购自Thermo；HBS-1096B型酶标仪购自南京德铁实验设备公司；显微镜购自上海炳宇光学仪器有限公司。

3 方法

3.1 细胞培养与分组 使用含10% 胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养HEC-1-B细胞，每隔2～3 d换液1次；0.25% 胰蛋白酶消化后传代。将HEC-1-B细胞以每孔1×105个接种于24孔板，常规培养至细胞融合度约50%， 按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书分别将control mimics和miR-195-5p mimics分别转染至HEC-1-B细胞，并标记为miR-con组和miR-195-5p组。另取适量HEC-1-B细胞随机分为空白对照(control)组和不同浓度IL-17干预组。Control组：细胞未做任何处理；不同浓度IL-17干预组：在细胞培养液中加入IL-17并调整终浓度分别为1、10、100 和 300 μg/L，继续培养48 h用于总RNA提取。

3.2 RT-qPCR实验 取适量人子宫内膜癌组织和良性子宫病变组织及各组细胞，充分研磨，采用TRIzol法提取总RNA，NanoDrop微量核酸测定仪检测RNA纯度和浓度。使用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，按照TaKaRa 荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系，以β-actin为内参照，进行PCR扩增，每个样品重复3次。实验结果分析方法采用2-ΔΔCt法。IL-17的上游引物序列为5′-ACCCCTCGGAAGTTGTAC-3′，下游引物序列为5′-CAGTCACCAGCACCTTC-3′；miR-195-5p的上游引物序列为5′-GATAGCAG CACAGAAATATTGGG-3′，下游引物序列为5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；β-actin的上游引物序列为5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物序列为5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′；U6的上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

3.3 MTT法检测细胞活力 取HEC-1-B细胞随机分为IL-17组、 IL-17+miR-con组和IL-17+miR-195-5p组。IL-17组在细胞培养液中加入IL-17并调整终浓度为100 μg/L；IL-17+miR-con组在转染control mimics的细胞培养液中加入IL-17并调整终浓度为100 μg/L；IL-17+miR-195-5p组在转染miR-195-5p mimics的细胞培养液中加入IL-17并调整终浓度为100 μg/L。上述细胞及control组、miR-con组和miR-195-5p组的细胞在培养0 h、24 h、48 h、72 h和96 h时加入20 μL浓度为5 g/L的MTT，继续孵育4 h；弃去多余培养基并加入150 μL二甲基亚砜振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm处吸光度(A)值。

3.4 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 收集control组、IL-17组、miR-con组、miR-195-5p组、 IL-17+miR-con组和IL-17+miR-195-5p组细胞，胰酶消化后使用无血清培养基重悬细胞，调整密度为2×107/L。取200 μL 细胞悬液分别接种于包被和未包被基质胶的小室并置于含完全培养基的下室中，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，去除培养基后用棉签轻轻擦去上层细胞，PBS洗涤，加入4% 多聚甲醛固定30 min，0.1% 结晶紫染色10 min，显微镜观察并随机选取6个视野拍照，计算结晶紫染色细胞数即为穿膜细胞数。

4 统计学分析

使用SPSS 22.0 软件进行分析。实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示，两组数据比较经正态性检验符合正态分布，采用独立样本t检验，多组差异比较经方差齐性检验后采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 子宫内膜癌组织中IL-17和miR-195-5p的表达

采用RT-qPCR法检测子宫内膜癌组织中IL-17和miR-195-5p的表达，结果表明，与benign组相比，cancer组中IL-17的mRNA表达上调(P<0.05), miR-195-5p的表达下调(P<0.05)，见图1。

Figure 1. The expression level of IL-17 mRNA and miR-195-5p in the endometrial cancer tissues. Mean±SD.n=36.*P<0.05vsbenign group.

图1 子宫内膜癌组织中IL-17 mRNA和miR-195-5p的表达

2 IL-17抑制HEC-1-B细胞中miR-195-5p的表达

以不同浓度IL-17干预HEC-1-B细胞48 h，RT-qPCR法检测细胞中miR-195-5p表达。如图2所示，10、100和300 μg/L的IL-17能显著抑制HEC-1-B细胞中miR-195-5p表达(P<0.05)，且浓度越高，抑制作用越明显，100和300 μg/L的IL-17干预后miR-195-5p表达水平无明显差异，因此选用100 μg/L进行后续实验。

Figure 2. IL-17 inhibited miR-195-5p expression in the HEC-1-B cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs10 μg/L group.

图2 IL-17抑制HEC-1-B细胞中miR-195-5p表达

3 IL-17增强HEC-1-B细胞的活力

使用100 μg/L IL-17干预HEC-1-B细胞48 h后，MTT法检测细胞的活力，结果显示， IL-17组的细胞活力显著高于control组(P<0.05)，且呈时间依赖性，见图3。

Figure 3. IL-17 increased the viability of HEC-1-B cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图3 IL-17增强HEC-1-B细胞的活力

4 IL-17促进HEC-1-B细胞的迁移和侵袭

Transwell实验检测HEC-1-B细胞的迁移和侵袭能力，发现视野内IL-17组的迁移细胞数和侵袭细胞数较control组显著增多(P<0.05)，见图4。

5 过表达miR-195-5p抑制HEC-1-B细胞的活力、迁移和侵袭

将miR-195-5p mimics转染至HEC-1-B细胞后，细胞的活力较miR-con组显著降低(P<0.05)，见图5A；视野内迁移和侵袭细胞数显著少于miR-con组(P<0.05),见图5B、C。

Figure 4. IL-17 promoted migration (A) and invasion (B) abilites of the HEC-1-B cells (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图4 IL-17促进HEC-1-B细胞的迁移和侵袭能力

Figure 5. Over-expression of miR-195-5p inhibited the viability (A), migration (B) and invasion (C) of the HEC-1-B cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-con group.

图5 过表达miR-195-5p抑制HEC-1-B细胞的活力、迁移和侵袭能力

6 过表达miR-195-5p可减弱IL-17对HEC-1-B细胞活力、侵袭和迁移的促进作用

MTT和Transwell实验结果可见，使用100 μg/L IL-17干预HEC-1-B细胞后，细胞活力增强(P<0.05)，迁移和侵袭细胞数增多(P<0.05)；而将miR-195-5p mimics转染至HEC-1-B细胞并联合100 μg/L IL-17干预后，细胞的活力有所下降(P<0.05)，视野内迁移和侵袭细胞数显著少于IL-17+miR-con组(P<0.05)，见图6。

讨 论

在我国，每年约有5万子宫内膜癌新发病例，死亡例数约1.8万，其发病率高居我国女性生殖系统恶性肿瘤首位，并且趋于年轻化[9]。研究表明，肥胖、糖尿病和激素类药物治疗等是子宫内膜癌的危险因素，采用影像学检查、血清肿瘤标志物检查、组织病理学检查等早期筛查方法有助于子宫内膜癌的明确诊断[10]。

白细胞介素(interleukins, ILs)是一类在免疫细胞增殖、活化和免疫应答等生物过程中起重要调节作用的细胞因子，其家族成员众多，且不同分子可交叉联系。随着研究的深入，ILs已被证实在类风湿性关节炎、银屑病、抑郁症、器官纤维化、癌症等疾病中发挥促进或抑制作用，并且已有多种以ILs为靶点的药物已被批准上市[11-12]，其中，IL-17可由辅助性T细胞17、中性粒细胞和自然杀伤细胞等多种细胞分泌，由6个亚型组成。据报道，IL-17在恶性肿瘤进程中具有双重作用：既能够通过促进肿瘤细胞生长和血管生成加剧肿瘤恶化，又能够通过增强免疫细胞清除能力抑制肿瘤发展[13-15]。Wei 等[16]研究发现，IL-17能够通过调节基质金属蛋白酶2，促进小鼠体内非小细胞肺癌肿瘤转移；并且IL-17在乳腺癌组织中高表达，在乳腺癌小鼠模型中进行IL-17静脉注射能够促进肿瘤生长[17]；而Tong等[18]研究发现，IL-17可抑制结直肠癌血管生成从而发挥抑癌作用。此外，已有证据表明，IL-17在人子宫内膜癌组织中呈高表达[19]。 本文采用RT-qPCR法检测表达发现，IL-17在子宫内膜癌组织中表达显著上调，使用外源性IL-17干预HEC-1-B细胞能够明显促进细胞的活力、迁移和侵袭。

Figure 6. Over-expression of miR-195-5p attenuated the promoting effect of IL-17 on the viability (A), migration (B) and invasion (C) of the HEC-1-B cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsIL-17+miR-con group.

图6 过表达miR-195-5p可减弱IL-17对HEC-1-B细胞的活力、侵袭和迁移的促进作用

微小RNA(microRNA, miRNA)是一类广泛存在于生物细胞中的一类小分子单链RNA分子，其本身不编码蛋白，参与调节胚胎发育、脂类代谢和个体形态形成等一系列生命活动。越来越多的证据[20]表明，miRNA在肿瘤的发生、转移和耐药等相关研究领域受到了广泛关注。miR-195位于人17号染色体，在乳腺癌和前列腺癌等多种肿瘤组织中表达异常，其表达水平与肿瘤转移、病情分级和患者预后等有关[21-22]。Zhen 等[23]研究发现，miR-195可调节细胞周期蛋白D1的表达，抑制宫颈癌细胞的活力；Li 等[24]研究发现，miR-195在结肠癌组织中低表达，过表达miR-195可通过调节β连环蛋白抑制细胞的活力、迁移和侵袭，是结肠癌诊断的标志物。此外，有证据表明,miR-195-5p在口腔鳞状细胞癌组织中表达下调，过表达miR-195-5p对癌细胞的活力、迁移能力和侵袭能力具有抑制作用[25]。本研究结果显示，miR-195-5p在子宫内膜癌组织中表达下调；使用外源性IL-17干预HEC-1-B细胞后，miR-195-5p表达水平显著降低。在HEC-1-B细胞中过表达miR-195-5p能有效抑制细胞活力、迁移和侵袭，并减弱外源性IL-17对HEC-1-B细胞活力、侵袭和迁移的促进作用。

综上所述，在子宫内膜癌组织中，IL-17高表达而miR-195-5p低表达；外源性IL-17干预可抑制HEC-1-B细胞中miR-195-5p表达并促进细胞活力、迁移和侵袭。IL-17和miR-195-5p可能是子宫内膜癌诊断标志物和靶向治疗的新靶点。