电针命门穴对FMR1基因敲除小鼠自主行为学及海马CREB蛋白表达的影响

齐诗仪，黄晓真，林 燊，杨晓婷，林 栋

（福建中医药大学针灸学院，福建 福州 350122）

脆性 X 综合征（fragile X syndrome，FXS）患者有着不同程度的注意力缺陷、语言障碍等行为，是目前最常见的与儿童精神发育迟滞密切相关的遗传性智力低下疾病之一［1］。其与位于Xq27.3的脆性X 智力障碍 1（fragile X mental retardation 1，FMR1）基因关系密切。FMR1基因突变可能导致其表达产物的缺失、减少或功能异常，从而引起FXS［2］。有研究表明敲除FMR1基因使得小鼠神经突触数量减少、发育异常，导致其认知及自主活动异常，这种模型鼠与FXS患者有许多相似特征［3-4］。祖国医学认为督脉“入络脑”，因而与脑的联系密切。研究表明，电针FMR1基因敲除小鼠长强穴能改变突触可塑性，进而改善脑功能［5-12］，而督脉上诸穴及以长强穴为中心的周边区域是否也有类似作用，尚待探索。因此，本文拟采用电针刺激督脉命门穴，观察FMR1基因敲除小鼠大脑海马区细胞内的环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）及其磷酸化蛋白p-CREB的表达，以探讨针刺命门穴在智力发育中的调控作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 FMR1基因敲除（knockout，KO）小鼠购于美国The Jackson Laboratory公司，饲养于福建中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK（闽）2014-0001。通过 PCR技术鉴定小鼠基因型，筛选FMR1基因遗传缺失且具有躁动不安、攻击性突出等表现特征的KO纯合子小鼠进行实验。

1.2 实验试剂 水合氯醛（天津市福晨化学试剂厂）；DNA提取试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］，一抗 CREB、p-CREB、β-actin（Proteintecch生物技术有限公司），二抗 Goat Anti-Rabbit IgG（北京依玛博科技有限公司）。

1.3 实验仪器 DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；PCR反应扩增仪（加拿大BBI公司）；ZZ-6小鼠自主活动测试仪（成都泰盟科技有限公司）；ZT-14S生物组织脱水机（湖北孝感市亚光医用电子技术有限公司）；GS-6R Centrifuge冷冻离心机（美国Beckman公司）；水平电泳仪（美国Bio-Rad公司）；凝胶成像系统（上海复日科技有限公司）；HANS-200A韩氏穴位神经刺激仪（北京华运安特科技有限责任公司）。

2 实验方法

2.1 PCR鉴定动物基因型 对28日龄FMR1基因敲除小鼠进行腮丛静脉采血，26℃水浴，按比例（血液∶Buffer TBP＝1∶2）混合后离心，去除上清液。 向沉淀物中加蛋白酶 K（Proteinase K）、裂解液（Buffer Digestion），置于56℃水浴加热；加入Buffer PR后离心，再加入异丙醇于室温放置后离心，向沉淀物加入75%乙醇离心，再向沉淀物加入TE Buffer后离心，得到DNA液体。于150 V、100 mA电泳20 min观察。

2.2 分组与干预 根据基因鉴定结果，采用随机数字表法将适龄KO小鼠分为空白组、命门组和非经非穴组各8只。命门组：参照《实验针灸学》［13］取命门穴，即第二腰椎棘突下向下直刺；非经非穴组：选取小鼠尾根与肛门之间凹陷旁开约1 cm的部位。命门穴组、非经非穴组使用华佗牌0.5寸针灸针自制成的双极连体针（如图1），进针深度约13～15 mm，双极针连接韩氏电针仪，设刺激频率2 Hz，强度2 mA，连续波，每日30 min，连续干预14 d；空白组：每日于相同时间、相同条件下仅模拟抓取动作。

图1 双极连体针

2.3 观察指标及方法

2.3.1 自主行为学检测 采用小鼠自主活动测试仪监测在自主活动实验中KO小鼠的站立次数及活动次数，于干预后连续测试2 d。3组于自主行为学检测结束后进行取材，并将其置于－80℃保存。

2.3.2 免疫组化染色 ① 将小鼠的右侧大脑置于4%多聚甲醛PBS溶液中固定，并分别浸泡于不同浓度梯度的酒精、二甲苯、蜡中进行脱水、浸蜡、包埋等步骤；② 将蜡块进行切片（厚度约3～5 μm），放入约40℃水中，待完全展平后将其用防脱载玻片捞起，置于37℃恒温箱中烘片；③ 将烘好的切片置于二甲苯、酒精、超纯水中，用枸橼酸对切片进行修复，依次滴加非特异染色阻断剂、一抗、生物素标记羊抗小鼠／兔IgG聚合物、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，于室温下孵育；④ 将切片周围水迹吸干，在切片上滴加DAB显色液显色，并用苏木素复染，晾干后用中性树胶封片。

2.3.3 Western blot法检测CREB、p-CREB蛋白表达 将海马从-80℃冰箱取出称量，按比例加入RIPA裂解液及PMSF蛋白酶抑制剂后研磨、静置、离心，在96孔板中滴加上清液进行蛋白定量测定。从定量完成的样品种取出部分总蛋白，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶在适当条件下进行电泳，电泳结束后将蛋白从SDS-聚丙烯酰胺凝胶转到提前用甲醇浸润过的PVDF膜上。按产品使用说明书中比例稀释一抗 CREB（1∶1 000）、p-CREB（1∶1 000）、βactin（1∶1 000）试剂，并加入密封袋，再将 PVDF 膜装入其中，放入4℃孵育12 h以上。洗涤PVDF膜3 次，加入二抗（1∶10 000），在室温下摇晃孵育 1 h，随后洗涤3次。将PVDF膜置于凝胶图像处理系统，显影及分析目标条带的分子量和净吸光度值。

2.4 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验。

3 结 果

3.1 实验小鼠基因鉴定表型结果 图2显示：1～4泳道约为400 bp，表明FMR1基因缺失，为KO纯合子小鼠；5～12泳道约为131 bp和400 bp，表明FMR1基因存在，为杂合子小鼠。

图2 PCR基因鉴定结果

3.2 3组小鼠自主行为活动及站立次数比较 如图3。

3.3 免疫组化法检测各组小鼠海马区CREB及p-CREB表达 见图4、图5。图4示，CREB免疫反应阳性细胞呈圆形，主要表达于各组小鼠海马CA3及齿状回；光镜下可见p-CREB免疫标记阳性表达，神经元胞浆和突起内均可见呈棕黄色免疫组化反应物质颗粒沉积，胶质细胞未见表达，空白组阳性颗粒表达稀疏，命门组阳性颗粒表达明显且排列密集，非经非穴组阳性颗粒表达浅淡而稀疏。

3.4 Western blot法检测小鼠海马区CREB及p-CREB蛋白表达的影响 见图6、图7。

4 讨 论

图3 3组小鼠自主活动及站立次数比较

图4 免疫组化法检测小鼠海马区CREB、p-CREB的表达（×40）

图5 免疫组化法检测小鼠海马区CREB、p-CREB的表达

图6 电针命门穴对小鼠海马区CREB蛋白表达的影响

督脉为“阳脉之海”。《素问·刺禁论》曰：“七节之旁，中有小心。”命门穴位于督脉后正中线上两“肾俞”穴之间的中点。明·张介宾所著《景岳全书》云：“命门为元气之根，为水火之宅。”故命门穴乃阳气之根本，具有调节人体阳气、补益肾阳、固本培元之功效［14］。小儿为纯阳之体，近年来通过针刺命门穴调节阳气对于某些儿科疾病疗效甚好［15］。海马是学习记忆的关键脑区［16］，前期研究以FMR1基因敲除小鼠为研究模型探讨长强穴改善智力低下的针灸效应，主要关注于脑源性神经营养因子的作用。本研究选取针刺命门穴并在效应蛋白中以海马区CREB与p-CREB作为主要的研究切入点，从而进一步探讨针刺效应的神经生物机制。

图7 电针命门穴对小鼠海马区p-CREB蛋白表达的影响

相关研究表明，KO小鼠在自主活动实验中活动次数增多而站立次数减少，主要在于小鼠中枢神经过度兴奋，使得小鼠行为异常［4］。而本研究结果显示，与空白组比较，电针干预命门组小鼠活动次数、站立次数均显著减少，说明电针命门穴会降低FMR1基因敲除小鼠中枢神经兴奋性，从而影响突触可塑性，改善脑功能，促使小鼠异常行为得到改善。

细胞内的CREB参与了长时程增强记忆形成和情绪产生的相关过程，并介导了对神经的保护作用［17］。CREB具有整合作用，是不同通路最终共同作用的蛋白［18-19］。电针额叶可能通过影响血管性痴呆大鼠海马区cAMP-PKA-CREB信号通路传导，从而提高其学习、记忆能力［20］。本课题既往研究证实，针刺长强穴改善智力低下的起效机制与CREB激活相关［5，8］。 本实验通过免疫组化检测，结果显示命门穴组海马区齿状回与CA3区的CREB蛋白表达量明显高于空白组与非经非穴组，进一步说明电针命门穴改善小鼠智力低下的起效机制与CREB表达量增加有关。而Western blot检测结果显示3组CREB蛋白表达无明显差异，分析原因可能为免疫组化法检测部位为海马CA3区及齿状回，而Western blot是检测整体脑区海马，因此可能出现误差，后续实验中将进一步改进方案。

针刺作为外界刺激信号刺激体表穴位，启动细胞膜上蛋白表达，随后激活细胞内PI3K激酶／Akt、MEK／ERK1／2 等多条信号传导通路［21-26］，不同通路最终导致CREB的磷酸化和激活，在核内启动mRNA转录相关蛋白如pro-BDNF，随后进行蛋白加工修饰通过胞吐形式释放到细胞外，产生“类递质”的作用，从而在神经元抗凋亡、突触形成以及学习记忆中起到重要作用［27］。因此，p-CREB成为重要的关注点。针刺对大鼠颅脑损伤后上调p-CREB的表达并呈一定规律性，提示p-CREB与颅脑损伤后脑组织的修复相关［28］。本实验在针刺干预后p-CREB表现出特异性表达，且命门组显著性更高，进一步说明外源性刺激促进信号蛋白磷酸化，且命门穴激活的效应更大。

基于上述的研究结果表明，针刺命门穴改善小儿智力低下的针刺效应可能和海马CA3区与齿状回p-CREB、CREB蛋白表达量有关。今后本课题组将进一步展开以皮质、小脑为检测部位的相关研究，进一步丰富针刺效应对精神发育迟滞的作用机制研究。