响应面法优化鸡α干扰素工程菌发酵培养基

陈 琼， 曹 丁， 昝继清， 李学优， 秦 鹏， 黄秀敏， 张宜靖

（广州市微生物研究所，广东广州 510663）

毕赤酵母表达系统是一类较早被人类成功改造、高效表达外源蛋白的系统，利用该系统表达外源基因具有良好的应用前景，是实现外源蛋白大规模生产进而推动其实现商品化的重要方法（Yu等，2018）。干扰素（IFN）是一类能诱导人及动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的类激素蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等功能。目前禽类干扰素发展滞后于哺乳动物干扰素，存在着生产成本过高，表达效价低，养殖业对其用量大，难以实现规模化生产等问题（王秀丽等，2017）。

本研究前期已构建并筛选出鸡α干扰素表达量高的毕赤酵母重组菌株，为改进干扰素生产工艺，解决摇瓶配方成本高、效价低的问题，本研究采用单因素试验和响应面法对毕赤酵母重组菌在摇瓶水平发酵培养基进行优化，以期获得低成本高表达量的发酵工艺条件，加快鸡α干扰素规模化生产的步伐。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 重组毕赤酵母：广东省微生物种质资源库保存提供；酵母提取物、胰蛋白胨（进口）：OXOID公司；玉米浆干粉：山东康源生物科技有限公司；酵母基础氮源培养基（YNB）：上海生工生物股份有限公司；PTM1盐：上海瑞楚生物科技有限公司；葡萄糖、K2SO4、MgSO4等试剂均为国产分析纯。752N紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SMART显微镜：重庆奥特光学仪器有限责任公司；LRH-250生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的配制 YPD培养基：1%酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖。发酵培养基：3%葡萄糖、1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.8%K2SO4、1.5%MgSO4、0.1%CaSO4、0.5%KH2PO4、0.15%KOH、pH 6.0、PTM1 盐 4.4 mL/L。

1.2.2 菌种摇瓶培养 将毕赤酵母从初始培养基平板接种至50 mL YPD摇瓶，30℃、180 r/min培养24 h。从YPD摇瓶以2%的接种量接至发酵培养基，于30℃、180 r/min培养48 h，取适量发酵液测定湿重。

1.2.3 培养基成分优化

1.2.3.1 不同碳源对毕赤酵母湿重的影响 将初始培养基中的碳源分别替换为甘油、葡萄糖、蔗糖、糖蜜和乳糖（浓度均为3%），设置不加碳源为对照组，其他成分不变。在相同培养条件下摇瓶发酵，测定菌体湿重。

1.2.3.2 不同氮源对毕赤酵母湿重的影响 根据碳源筛选试验的结果，选取甘油作为碳源进行氮源优化试验。将初始培养基中的氮源分别替换为玉米浆干粉、YNB、NH4H2PO4、酵母提取物、蛋白胨、（NH4）2SO4和 NH4Cl（浓度均为 3%），设置不加氮源为对照组，其他成分不变。在相同培养条件下摇瓶发酵，测定菌体湿重。

1.2.4 Plackett-Burman试验设计 Plackett-Burman设计是通过对可能影响响应值的每个因子取高低两个水平来进行分析，通过比较各个因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性。利用Minitab软件，对发酵培养基的8个因素进行Plackett-Burman组合设计，各个因素及水平如表1所示，其中“-”和“+”分别表示因素的低水平和高水平（胡瑞萍等，2018）。以菌体湿重（Y）作为试验的响应值，共进行12组试验，考察各个因素的主效应和交互效应的一级作用，从中筛选出对菌体湿重具有显著作用的3个因素。

表1 Plackett-Burman设计各因素及其水平

1.2.5 最陡爬坡试验 响应面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分近似真实情形，在其他区域拟合方程与被近似的函数方程毫无相似之处，几乎无意义。因此，要先逼近最佳值区域后才能建立有效的响应面拟合方程。因此通过最陡爬坡法以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据Plackett-Burman试验结果中显著因素效应值的大小确定变化步长，确定响应面的中心点和最大值范围（姚兵莉等，2018）。

1.2.6 Box-Behnken响应面优化 根据上述最陡爬坡试验结果，3个因素的水平已在最优点附近，可以此浓度为中心点采用Box-Behnken响应面试验建立模型，选取3个因素，如表2所示。将因素对响应值的关系通过拟合二次方程，来对发酵培养基作进一步的优化，以寻求最优值。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对毕赤酵母湿重的影响 由表3可知，培养基中未添加碳源，严重影响毕赤酵母的发酵水平。当添加不同碳源时，毕赤酵母湿重均有一定程度的提高，最佳碳源为甘油，此时菌体湿重最高达到81.5 g/L；其次是糖蜜，葡萄糖。

表2 Box-behnken试验设计各因素水平及其编码值

表3 不同碳源对毕赤酵母湿重的影响

2.2 不同氮源对毕赤酵母湿重的影响 表4的结果显示，蛋白胨和NH4H2PO4生物量比较接近，但有机氮源成本相对较高，且不利于后期纯化，因此选择NH4H2PO4作为氮源进行下一步试验。

表4 不同氮源对毕赤酵母湿重的影响

2.3 Plackett-Burman试验结果与分析 Plackett-Burman试验由软件Minitab设计，共8个因素1个虚拟变量12次试验。各因素对菌体湿重的具体影响依然采用Minitab软件进行分析，对显著性水平大于95%作为重要因素。

由表5、表6和表7结果分析可得：在α=0.05水平上，甘油含量对响应值影响较大，且效应能力由强到弱排序分别为甘油、NH4H2PO4、初始pH、CaSO4。初始pH、甘油含量对生物量具有正促进作用，需适当增加，NH4H2PO4对生物量具有负促进效果，应适当减少，可使生物量增加。R-Sq=99.48%＞75%，说明该模型线性关系良好，回归显著，符合实际，是可信的。

2.4 最陡爬坡试验结果与分析 最陡爬坡试验设计及结果见表8。随着甘油、NH4H2PO4和初始pH的变化，五组不同配方培养基中菌体湿重先升高后降低。在甘油浓度4.4%、NH4H2PO4浓度1.6%、初始pH 7.0时，菌体湿重达到最大值为162.9 g/L，以此作为后续试验中心点进行响应面分析。

2.5 响应面试验结果与分析 根据Boxbehnken试验结果 （表9），利用软件Design Ex-pert对其进行回归分析，其回归方程为：Y=161.30-0.1125X1-1.35X2-2.6125X3-5.825X1X2+1.05X1X3+2.275X2X3+6.15X12+0.675X22-10.5X32。经过软件分析，经F值检验，检验P值越小，则变量的显著性越高。由表10可知，该回归模型（P＜ 0.0001）极显著，模型失拟项（P=0.2754）为不显著，说明本模型的整个回归区域拟合较好。模型的相关系数R2=0.9961，校正系数RAdj2=0.9481，表明该回归方程能很好的模拟预测真实的响应值。该方程中 X2、X3、X1X2、X2X3、X12、X32（P ≤ 0.01）对湿重影响为极显著；X1X3（0.01＜P ≤ 0.05）对湿重影响为显著。

表5 Plackett-Burman试验设计及结果

表6 Plackett-Burman试验各因素对响应值的估计效应及系数

表7 生物量（g/L)的方差分析

表8 最陡爬坡试验设计及菌体湿重

表9 Box-Behnken试验设计及结果

表10 响应面回归方程的显著性及方差分析

利用软件Design Expert考察各因素及其相互作用对酵母湿重的影响，保持其他因素不变，获得任意两个因素及其相互作用对湿重的响应曲面图。由图1、2、3可判断，等高线为椭圆状，各因素之间具有明显的交互作用，响应面弧度不明显，说明范围选择较小（甘祥武等，2018）。

图1 甘油与pH交互影响

图2 磷酸二氢铵与pH交互影响

根据软件，进行最高湿重预测，当X1为1，X2为-1，X3为-0.182， 即甘油浓度为 46 g/L，NH4H2PO4为 14 g/L，初始 pH为 6.96时，酵母湿重达到最高值，为175.54 g/L。

3 结论

图3 磷酸二氢铵与甘油交互影响

本文采用响应面法优化高产鸡α干扰素毕赤酵母重组菌发酵培养基，通过碳源、氮源的筛选，Plackett-Burman试验，最陡爬坡试验综合响应面建模，确定最佳培养基配方为：甘油 46 g/L，NH4H2PO414 g/L，K2SO418 g/L，MgSO415 g/L，Ca-SO41.0 g/L，KH2PO45 g/L，KOH 1.5 g/L， 初始 pH 6.96，PTM1盐4.4 mL/L。在此条件下，毕赤酵母发酵湿重为175.54 g/L，生物量比优化前提高了50%，并且培养基组分成本低廉，成分简单，方便调控和后期分离纯化，适合大规模发酵生产。