牦牛血发酵的最佳菌种组合及最优发酵条件探究

陈宇星，郑玉才，谈永萍，饶开晴

（西南民族大学 生命科学与技术学院，四川成都 610041）

目前，国内对畜禽血液的利用率和加工程度普遍偏低，产品主要是以饲用血粉和食用血豆腐等为主的初加工产品（Wang等，2014；张玉斌等，2011）。已有研究表明，牛血相较于猪血等其他畜血营养丰富，其蛋白质含量较高，富含矿物质元素和氨基酸，且赖氨酸含量较高 （赵晓丹等，2016）。但同时也存在腥味较重、消化性和适口性差、色泽感官不佳且原料血液极难保存等缺陷。饲料加工领域中采用微生物发酵法处理畜血成本低，能提高营养成分的利用率，可以去除多种抗营养因子，而且能生成有益的代谢产物和益生菌 （杜昕等，2017；鲁云风等，2010）。陈宇等（2003）采用复合菌株对猪血进行发酵，发酵产品香味浓郁 ，营养丰富，蛋白质含量高达 69% ，且富含游离氨基酸和无机元素。张滨等（2005）采用多菌种发酵而成的微生态多菌株发酵血液产品，含可溶性蛋白质达20%以上，且发酵血液具有特殊的芳香，无异味。方俊等（2006）研究发现，发酵温度与时间及接种量对猪血小肽的生成有显著影响。俞炜洋（2012）研究发现，猪血发酵后粗蛋白质降解剂量、氨基酸含量显著提高，并有部分蛋白质降解成为小肽。程伟等（2014）研究表明，在生长猪饲粮中使用6%～7%微生物发酵复合蛋白质原料替代豆粕可显著提高其平均日增重、营养物质表观消化率和经济效益。

我国是牦牛主产国，饲养量占世界牦牛总数的90%以上，具有明显的数量优势 （杨斌等，2010）。牦牛生存在基本无污染的特殊环境，牦牛产品及副产物被认为是真正的绿色产品（Wang等，2007）。目前采用微生物发酵法处理牦牛血的研究较少，特别是对于牦牛血的发酵菌种组合及发酵工艺鲜有报道，本研究旨在通过探究能优化牦牛血营养结构、增加适口性的牦牛血最佳发酵菌种组合及发酵条件，提高牦牛血的深度和综合利用价值。

1 材料和方法

1.1 试验材料 新鲜牛血液采自四川省新都区牦牛屠宰场，添加0.3%柠檬酸钠混合均匀；酵母菌（安琪高活性干酵母，购于安琪酵母股份有限公司）、黑曲霉菌（黑曲霉孢子粉，购于河南中广农业信息开发有限公司）、米曲霉菌（米曲霉孢子粉，购于沂源康源生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 固态发酵 以麦麸为辅料，按照一定比例加入新鲜牛血，用电子天平精确称取葡萄糖2%，尿素0.4%，相应添加量的磷酸二氢钾混合均匀，装入透气的40目筛子中，盖上纱布，加少量水保持湿润，放置试验设定温度的培养箱中恒温培养。

1.2.2 可溶性蛋白质含量测定 按照中华人民共和国轻工行业标准大豆肽粉标 （QB/T2653-2004）：称取样品 2.00 g，加入 15%三氯乙酸（TCA）溶液 10 mL，混合均匀，静置 5 min。将溶液定量转移，在4000 r/min下离心10 min后，取全部上清液，按照粗蛋白质的检测方法测定其含氮量（张丽英，2007）。

1.2.3 菌种筛选试验 参照李建鑫等（2000）的方法，采用正交试验设计对牦牛血发酵的菌种组合进行筛选。采用L9（33）正交试验设计，设置菌种组合、发酵温度及磷酸二氢钾添加量3个因素，每因素3水平（见表1）。

表 1 L9（33）正交试验设计表

1.2.4 单因素试验 选用磷酸二氢钾添加量、麦麸添加量、菌种接种量、发酵温度、发酵时间、菌种添加比例6个因素进行单因素试验。

1.2.4.1 发酵时间 按照0.3%的菌种接种量，菌种比例为1∶1，麦麸添加量为50%，磷酸二氢钾添加量为0.4%，混合均匀，在30℃恒温，分别培养24、36、48、60、72 h，每个处理设置 2 个平行。

1.2.4.2 发酵温度 按照0.3%的菌种接种量，菌种比例为1∶1，麦麸添加量为50%，磷酸二氢钾添加量为0.4%，混合均匀，分别在24、26、28、30、32℃恒温培养72 h，每个处理设置2个平行。

1.2.4.3 菌种接种量 按照磷酸二氢钾添加量为0.4%，菌种比例为1∶1，麦麸添加量为50%，黑曲酶接种量分别为 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，混合均匀，每个处理设置2个平行，在30℃恒温培养72 h。

1.2.4.4 磷酸二氢钾添加量 按照0.3%的菌种接种量，菌种比例为1∶1，麦麸添加量为50%，分别添加磷酸二氢钾为 0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，混合均匀，每个处理设置2个平行，在30℃恒温培养72 h。

1.2.4.5 麦麸添加量 按照0.3%的菌种接种量，磷酸二氢钾添加量为0.4%，菌种比例为1∶1，麦麸含量分别为 30%、40%、50%、60%、70%，加入新鲜牛血混合均匀，每个处理设置2个平行，在30℃恒温培养72 h。

1.2.4.6 菌种添加比例 按照0.3%的菌种接种量，尿素添加量为0.4%，麦麸添加量为50%，磷酸二氢钾添加量为0.4%，菌种添加比例为0.2、0.6、1、1.4、1.8，加入新鲜牛血混合均匀，每个处理设置2个平行，在30℃恒温培养72 h。

1.2.5 响应面法优化设计试验 参照李明华等（2016）的方法，以单因素试验为基础，最终筛选出3个自变量：发酵时间、发酵温度、辅料比例作为响应面分析的因素，采用响应面法依据Box-Behnken试验原理设计3因素3水平试验，进一步优化最佳工艺条件。检测指标为可溶性蛋白质增加量，试验编码和水平如表2所示。

表2 试验因素水平及编码

1.3 统计分析 正交试验及单因素试验利用SPSS 18.0进行分析作图，响应面试验数据采用Design-Expert V8.0.6软件处理分析。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选试验 由表3可知，因素A及菌种组合对可溶性蛋白质的增加量有显著影响 （P＜0.05）。发酵温度、磷酸二氢钾添加量对发酵牦牛血中可溶性蛋白质含量无显著影响（P＞0.05）。其中酵母菌+黑曲霉的组合可溶性蛋白质增加量显著高于酵母菌+米曲霉和黑曲霉菌+米曲霉的菌种组合，因此筛选出酵母+黑曲霉为最佳组合并用于后续试验。

表 3 L9（33）正交试验结果

2.2 单因素试验 采用酵母菌加黑曲霉的组合发酵牦牛血，发酵时间、发酵温度、菌种添加量、磷酸二氢钾添加量、麦麸添加量、酵母菌与黑曲霉的菌种比例对可溶性蛋白质含量的影响，如图1所示。由图1-a和1-b可以看出，发酵时间和发酵温度对可溶性蛋白增加量影响显著，且随发酵时间和发酵温度增加呈现先增加后减小的趋势。最适发酵时间为48 h左右，最适发酵温度为28℃左右。由图1-c和1-d可知，菌种添加量达到0.3%后对可溶性蛋白质含量影响不显著；磷酸二氢钾对可溶性蛋白质含量影响不显著。由图1-e可以看出，麦麸添加量对可溶性蛋白质的含量影响显著，且随着麦麸添加量的增加呈增加的趋势；由图1-f可知，酵母菌与黑曲霉的菌种比例对发酵牦牛血中可溶性蛋白质含量的影响显著，在酵母菌和黑曲霉比值为0.6左右时可溶性蛋白质含量最高。

2.3 响应面试验分析

2.3.1 回归模型的建立及方差分析 如表4所示，按照Box-Benhnken设计进行试验，所得数据由Design Expert 8.0.6软件进行分析，建立R1（可溶性蛋白质增加量）关于编码自变量A（菌种比例）、B（发酵温度）、C（麦麸添加量）的二次多项回归方程：

图1 单因素对可溶性蛋白质含量的影响

表4 响应面试验设计与结果

对二次多项回归方程进行多因素方差分析可知（表5），本试验构建的二次多项模型具有极高的显著性（P ＜0.001），失拟项不显著（P=0.554），表明该模型与试验拟合良好，自变量与响应值之间存在显著的线性关系，能够描述和预测不同培养条件对小肽增加量的影响。

表5 回归模型方差分析表

由表5可知，回归方程一次项C的P值小于0.01，影响极显著，而A的P值小于0.05，影响显著，表明菌种比例和麦麸添加量因素均能显著增加可溶性蛋白质的含量；二次项C2的P值小于0.05；交互项的P值均大于0.05，表明三个因素之间没有互作效应。上述结果说明，小肽增加量会受到以上2个因素的影响，且影响程度依次为：辅料比例＞菌种比例。

2.3.2 二次项交互分析 菌种比例、发酵温度和麦麸添加量两两交互作用对可溶性蛋白增加量的影响如图2～4所示。

由图2～4可以看出，菌种比例与发酵温度、菌种比例与麦麸添加量、发酵温度与麦麸添加量的交互作用均不显著。一个因素不变，随着其他因素的变化，可溶性蛋白质呈现先增大后减小的趋势，可溶性蛋白增加量呈现极值。

2.3.3 回归模型的验证 应用Design-Expert 8.0.6软件求得二次曲面方程的极值得到：当酵母菌和黑曲霉比例为0.4、发酵温度为30℃、辅料比例为73.5%时，可溶性蛋白质增加量最高，为8.25%。为确保回归模型推算的预测值相对准确，本试验又对优化后的培养条件进行验证，并对原始培养条件下和优化条件下的小肽含量进行对比，结果如表6所示，与原始培养条件相比，响应曲面优化的小肽含量提高了8.4%，表明实际值与预测值拟合程度高，在优化后的培养条件下能够有效提高小肽的含量，且粗蛋白质含量增加，粗纤维含量减少。

图2 菌种比例和发酵温度对可溶性蛋白增加量的响应曲面

图3 菌种比例和麦麸添加量对可溶性蛋白质增加量的响应曲面

图4 发酵温度和麦麸添加量对可溶性蛋白质增加量的响应曲面

表6 原始培养条件下与优化后营养成分的对比%

3 结论

本文采用不同菌种组合对牦牛血进行发酵，发现黑曲霉、米曲霉、酵母菌的不同组合对牦牛血发酵后可溶性蛋白质的含量有显著影响，通过L9（33）正交试验筛选出最佳组合为黑曲霉+酵母菌组合。在单因素条件试验的基础上进一步利用Box-Behnken试验设计原理构建牦牛血发酵工艺的响应面模型，并通过回归分析得到最佳的发酵工艺条件为：菌种添加量0.3%、菌种比例（酵母菌比黑曲霉）0.4、发酵温度30℃、辅料比例73.5%、发酵时间48 h、磷酸二氢钾添加量0.4%，并验证在此条件下发酵牦牛血可溶性蛋白质含量增加8.4%，与预测值基本符合，并且发酵后改变了牛血的营养结构，增加了粗蛋白质含量，减少了粗纤维含量，颜色鲜亮，具有酵母发酵的香味。