一株产高温纤维素酶菌株的筛选、鉴定及其酶学性质研究

杨力权 ， 周连广 ， 陈贵元 ， 桑 鹏 *

（1.大理大学农学与生物科学学院，云南大理671003；2.大理大学基础医学院，云南大理671000；3.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理671000）

纤维素是光合作用的初级产物，占植物干重的35%～50%，是分布最广、含量最丰富的碳水化合物（Zhang 等，2006；Kubicek 等，1993）。 但是纤维素的结构十分稳定，只有很少一部分能够被利用，更多的被浪费甚至造成污染。如何有效地开发利用纤维素资源已成为当今研究的热门课题。研究表明，利用生物酶的水解作用，可以促使纤维素降解，但生物酶的生产具有酶活力低和生产成本高等问题，阻碍了生物酶的实际应用。因此，进一步寻找和开发高产纤维素酶菌种，是纤维素资源高效利用的关键。目前，已分离到产纤维素酶的微生物主要集中在真菌、放线菌和部分酵母菌等（Yang 等，2009；Alani等，2008），对于细菌产纤维素酶方面的研究还鲜有报道。本研究以大理弥渡县热泉土样为材料，筛选出能耐高温产纤维素酶的菌株，分类鉴定及研究酶学性质，为纤维素酶的发酵工业新备选菌株的开发应用提供资源，为进一步开发利用该菌株及获得产纤维素酶基因的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品 土壤样品来自大理弥渡县石夹泉热泉的底泥，热泉水温55℃。

1.1.2 主要仪器 显微镜（奥林巴斯）；紫外可见光分光光度计（上海菁华仪器公司）；高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器公司）；恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；水浴恒温摇床（常州国华电器有限公司）；高压蒸汽灭菌锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；PCR扩增仪（美国ABI）；电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

1.1.3 试剂 酵母抽提物、蛋白胨为英国进口；琼脂粉为西班牙进口分装；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、氯化钠、结晶紫、碘、乙醇、孔雀绿、番红均为国产分析纯试剂。DNA抽提试剂盒、PCR扩增试剂盒、胶回收试剂盒和DNA分子量标准品均购自北京天根生物技术有限公司。

1.1.4 培养基 LB液体培养基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉 5.0，NaCl 10.0，pH 7.2，121 ℃灭菌 20 min。

羟甲基纤维素培养基 （g/L）：（NH4）2SO42.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 5.0，CMC-Na 15.0，pH 7.2，121℃灭菌20 min。固体培养基添加2%琼脂。

羟甲基纤维素刚果红培养基（g/L）：K2HPO40.5，MgSO40.25，CMC 1.88，刚果红 0.2，明胶 2.0，琼脂 14.0，pH 7.2，121 ℃灭菌 20 min。

稻草发酵培养基 （g/L）：稻草10.0，蛋白胨5.0，NaCl 5.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.2， 酵母粉 5.0，葡萄糖 1.0，pH 7.2，121 ℃灭菌 20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株富集 称取石夹泉热泉底泥2.0 g于45 mL的无菌蒸馏水中，150 r/min，振荡15 min。在无菌条件下，用移液枪吸取5 mL悬液于50 mL的富集培养基中，将接种好的富集培养基置于43℃转速为150 r/min的水浴恒温振荡培养箱中振荡培养24 h。

1.2.2 菌株初筛 将富集好的菌液稀释至10-3、10-6、10-9倍，用移液枪分别吸取稀释的菌液150 μL接种在筛选培养基平板上，涂布均匀。于37℃，倒置培养24 h。观察菌落周围若有透明圈出现，说明该菌株能产生纤维素酶。

1.2.3 菌株复筛 将初筛得到的菌株取少量接种于种子瓶（LB液体培养基），55℃，培养24 h后，将种子液按2%的接种量接入到发酵培养基，55℃，150 r/min水浴摇床培养1周。离心取上清测酶活。

酶活测定：参照 Hardin（2000）和 Ghose（1987）的方法进行测定。酶活力单位（U）：在一定条件下，每毫升酶液每分钟水解底物生成1 μmol葡萄糖的能力定义为1个酶活力单位。

1.2.4 菌株鉴定

1.2.4.1 形态学、生理生化特征 产酶菌株的形态观察及生理生化试验参照黄秀梨等（2008）的方法进行。

1.2.4.2 16S rRNA基因序列测序和分析 根据北京天根生化科技有限公司提供的试剂盒以及说明书进行DNA的提取。使用通用引物 27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’扩增细菌 16S rDNA。扩增条件为：预变性94℃，5 min，变性94℃，30 s，退火 50 ℃，45 s，延伸 72 ℃，100 s，最后延伸72℃，5 min，循环30次，将PCR产物加入预先制备好的0.8%琼脂糖凝胶中，140 V，电泳1 h，琼脂糖凝胶回收根据北京天根生化科技有限公司提供的试剂盒以及说明书进行。将PCR回收产物送广州英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，将获得的序列提交GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），根据BLAST数据库中细菌16S rRNA基因序列进行相似性比较分析，利用MEGA 5.0软件进行系统进化分析。

1.2.5 菌株最适生长温度 按接种量为1%接种于LB液体培养基中，置于不同的温度（25、31、37、43、49、55 ℃）下摇床培养 24 h，然后在波长600 nm处测定各个温度下菌株生长的吸光值，以确定菌株的最适生长温度。

1.2.6 酶学性质

1.2.6.1 温度对酶活力的影响 将酶液分别在4～85℃条件下测定纤维素酶的活力。

1.2.6.2 pH对酶活力的影响 在最适酶活温度下，配制不同pH的反应缓冲液，检测不同pH对纤维素酶活力的影响。

1.2.6.3 酶的热稳定性 将1 mL酶液分别置于不同的温度（4、25、37、55、75 ℃）下保温，在保温15、30、60、90、120 min 时测定酶活。 以保温 0 min各温度下所测得的酶活为对照组，不同温度保温不同时间，所测得的酶活与相应温度保温0 min所测得的酶活相比，并计算相对酶活，用相对酶活绘制出酶的热稳定性曲线。

1.2.6.4 金属离子对酶活力的影响 将1 mL的酶液和10 μL浓度为0.1 mol/L的金属离子（Ca2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、K+）混匀，将其放置到 4 ℃冰箱过夜，第二天测定各组酶活力。以未加入金属离子的酶液反应体系作为对照组，测定和观察金属离子对酶活力的影响。

2 结果与分析

2.1 产酶菌株的筛选 根据水解圈直径与菌落直径比值的大小。筛选出5株产高温纤维素酶菌株。其中1号菌株水解圈直径与菌落直径比值（R1/R2）最大。经复筛发现5株菌均为分泌型纤维素酶产生菌，且1号菌株酶活最高，达到59.94 U/mL，与初筛的结果相符。因此，选择1号菌株作为后续试验研究菌株，命名为Cel-55。

2.2 菌种鉴定

2.2.1 形态学、生理生化特征 Cel-55在LB培养基上37℃培养72 h后，菌落呈乳白色，不透明，圆形隆起，黏稠，不易挑取。革兰氏染色为阳性，菌体呈杆状，有中生芽孢。

对Cel-55的生理生化特性进行研究，发现V-P试验、吲哚试验、明胶试验结果均为阳性；甲基红试验结果为阴性；乳糖发酵试验结果为阴性；葡萄糖发酵试验、蔗糖发酵试验结果均为能利用糖，但不产气。

2.2.2 16S rRNA基因序列及系统发育分析 16S rRNA基因测序，所获得的序列长度为1436 bp，将Cel-55的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，发现Cel-55与芽孢杆菌属的16S rRNA基因序列自然聚类，Cel-55的16S rRNA基因序列与15条相似性较高的序列构建系统发育树（图1），从图中可以看出，Cel-55与 Bacillus aryabhattaistrain WU-7（MH174183.1） 和 Bacillus megaterium strain N3（MH715353.1）的菌株聚为一群，相似性也最高，表明Cel-55与Bacillus sp.亲缘关系最近。

图1 基于16S rRNA基因序列相似性的菌株Cel-55与15株细菌的系统进化树

根据Cel-55的形态及生理生化特征，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）（布坎南等，1984），以及Cel-55 16S rRNA基因序列及系统发育树，将Cel-55初步鉴定为芽孢杆菌属 （Bacillussp.）的一株菌，命名为Bacillussp.Cel-55。

2.3 菌种的最适生长温度 在波长600 nm处测定不同温度培养下LB培养基的吸光值，以600 nm处的吸光值为纵坐标，温度为横坐标作温度-吸光值关系曲线，结果如图2。

由图2可知，25～37℃，菌体的生长量随着温度的升高而增加，37℃时，LB培养基在600 nm下的吸光值最高，表明37℃是菌株的最适生长温度。37℃以后，菌体生长量随着温度的升高而下降，菌株在55℃下还有一定生长，表明菌株属于典型的耐高温菌。

图2 Cel-55菌株生长曲线

2.4 菌株Cel-55的纤维素酶性质

2.4.1 葡萄糖标准曲线 根据制作葡萄糖标准曲线的方法，制作出的葡萄糖标准曲线线性回归方程为y=0.8632x-0.0721，线性相关性R2=0.9947，表明线性比较好。

2.4.2 温度对酶活的影响 在不同温度下测定酶的活性，以酶活力为纵坐标，温度为横坐标作温度—酶活关系曲线（图3）。

图3 温度对Cel-55纤维素酶活性的影响

从图3可以看出，低温能抑制酶的活性，但不能使酶失活，在4℃的条件下，纤维素酶仍具有活性，但活性较低，4～75℃，随着温度升高，酶活力增加，在75℃时，酶活力达到最大值，为59.94 U/mL。在75℃之后，随着温度升高，纤维素酶活力反而降低，部分酶失去活性。酶反应都有一个最适反应温度，在没有达到最适反应温度之前，酶活力随着温度升高而增加，温度超过最适反应温度，酶开始失活，反应速度降低，75℃是纤维素酶的最适反应温度，菌株产生的纤维素酶属于典型的耐热纤维素酶。

2.4.3 纤维素酶的最适反应pH 从图4可以看出，pH 5.0之前，纤维素酶活力随着pH的升高而升高，在pH 5.0之后，纤维素酶活性下降且下降速度较快，酶促反应都有最适pH，当反应体系pH大于或者小于酶促反应的最适pH时，酶活力相对于最适酶促反应pH条件下的酶活力较低。pH 5.0是该纤维素酶的最适反应pH，表明菌株Cel-55产生的纤维素酶属于酸性纤维素酶。

图4 pH对Cel-55纤维素酶活性的影响

图5 Cel-55纤维素酶的热稳定性

2.4.4 纤维素酶热稳定性 测定各个温度下不同时间点纤维素酶的酶活，以保温0 min各温度下所测得的酶活为对照组，其余温度不同时间下所测得的酶活与其相比并计算相对酶活，用相对酶活绘制出酶的热稳定性曲线，结果如图5所示。从图5可以看出，纤维素酶在37℃以下，能够在长时间内保持相对稳定的酶活。酶在75℃保温120 min，酶活损失近20%，表明该酶热稳定性较好。菌株产生的酶虽然是高温纤维素酶，但酶在较高的温度下，酶活性随着保温时间的增加而降低，温度耐受性质符合一般酶的性质。

2.4.5 金属离子对酶活力的影响 本试验中，将加有金属离子的稀释酶液在4℃中保温过夜，以未加入金属离子的酶液反应体系作为对照组，测定各种金属离子对酶活力的影响结果，结果见表1。

表1 金属离子对Cel-55酶活的影响 %

从表 1 可知，Zn2+、Mn2+、Ca2+、K+、Mg2+、Fe2+、Cu2+均对Cel-55纤维素酶活力起一定的抑制作用，其中Mg2+的抑制效果最为明显。金属离子通过与酶的活性中心结合，影响酶活性。因此，Zn2+、Mn2+、Ca2+、K+、Mg2+、Fe2+、Cu2+均能与酶的活性中心基团结合，抑制酶的活性中心与底物结合，使酶活性降低。

3 结论

大多数商业化的纤维素酶是中温真菌的胞外酶，虽然水解活力高，但在高温环境下易失活。由于大多数工业过程都在高温下（＞60℃）进行，因此对嗜热/耐热纤维素酶的需求越来越迫切。近年来，在研究耐热纤维素酶的过程中，嗜热真菌（最适生长温度在50℃及以上的真菌被称为嗜热真菌）引起了广泛关注。嗜热真菌所产的纤维素酶通常在pH 3.0～11.0有活性，最适作用温度一般在60～75℃，且在长时间的保温过程中具有较好的热稳定性 （Li等，2011；Liu 等，2006；Wojtczak等，1987）。实际上，除了嗜热真菌，嗜热细菌也可产生嗜热纤维素酶。

本研究从大理弥渡白总旗热泉筛选到一株能向胞外分泌高温纤维素酶的菌株，经初步鉴定为芽孢杆菌属的一株菌，命名为Bacillus sp.Cel-55。菌株最适生长温度为37℃，菌株在55℃仍能生长。酶学性质研究表明，最适作用温度为75℃，最适pH为5.0，为酸性纤维素酶。酶在25℃以下能在较长时间内保持稳定，Ca2+、Mn2+、K+、Fe2+、Cu2+、Zn2+和 Mg2+对 Cel-55纤维素酶的活力有一定的抑制作用。