控制性打开二硫键-葡聚糖修饰对大豆分离蛋白表面活性性能及结构的影响

王碧璇 ， 李军生 *， 钟新 ， 阎柳娟 ， 黄国霞

（1.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州 545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室，广西柳州 545006；3.广西高校糖资源加工重点实验室，广西柳州 545006）

大豆分离蛋白作为重要的植物蛋白来源，具有丰富的营养价值以及广泛的功能特性，其中，乳化性以及起泡性是大豆分离蛋白最重要的功能之一。随着食品工业的发展，提高表面活性变得至关重要，目前通过物理、化学、酶等改性方法，改善大豆分离蛋白的表面活性。王松等（2014）探讨了大豆分离蛋白与葡萄糖的最优条件，制备了大豆分离蛋白-葡萄糖的复合产物，最终得到产物的乳化活性是大豆分离蛋白的3.94倍，Wang等（2013）添加了乳糖进行糖基化修饰，发现其乳化性和乳化稳定性是未经过修饰的2.32倍和2.67倍，由此说明糖基化可以有效改善大豆分离蛋白的表面活性。

受蛋白质特殊结构的限制，大部分的疏水性氨基酸被包裹在分子内部，因此大多数糖基化发生在分子的表面。本研究采用绿色的氧化剂，对蛋白质进行氧化，将蛋白质内部二硫键的非共价力作用控制性的断开，使得内部的疏水性基团暴露在分子的表面。在此基础上，引入葡聚糖分子。通过对大豆分离蛋白的结构、性能进行分析，可以为大豆分离蛋白的开发和利用提供更好的思路，并且为大豆蛋白改性提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 豆粕，市售；葡聚糖购自上海源叶生物有限公司；邻苯二甲醛购自国药试剂；其他试剂均为分析纯，购于西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备 高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；紫外可见分光光度计（Agilent Technologies）；荧光分光光度计（日本岛津公司）；马尔文纳米粒度和Zeta电位分仪（英国马尔文仪器有限公司）；电泳仪（美国Bio-Rad伯乐公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 大豆分离蛋白的制备 将购得的豆粕研磨，过80目筛。得到的蛋白粉按照重量体积比1：10溶于去离子水中。用2 mol/L的NaOH调节pH至7.0，搅拌1 h，悬浮液以8000 r/min离心30 min。得到的上清液用2 mol/L的HCl调节pH至4.5，5000 r/min离心30 min，得到的蛋白质溶液用冷冻干燥机干燥，研磨成大豆分离蛋白粉，待用。以上所有的工作均在室温下完成。

1.3.2 大豆分离蛋白的氧化 将1.25 g大豆分离蛋白溶于50 mL缓冲溶液当中，依次加入0、0.1、0.2、0.5、0.7、0.9 mL 过氧乙酸，得到的混合物置于4℃的黑暗环境中反应，过夜。

1.3.3 大豆分离蛋白糖基化反应 取一定量的大豆分离蛋白进行氧化，按蛋白质与糖1∶2的量进行反应，蛋白质、葡聚糖混合后磁力搅拌10 min，加入到50 mL具塞试管中，在100℃下加热，反应1 h，反应结束后，立即放入冰水浴中冷却，待测（或者冷冻干燥）。

1.3.4 二硫键含量的测定 采用 Ellman（1959）法稍作修改；配制浓度为0.1%DTNB，以及 0.1%NTSB试剂。测游离巯基时，取0.4 mL待测样品，加入0.4 mL DTNB，用pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液定容至10 mL。当测定总巯基时，将DTNB替换为NTSB即可。在室温下反应20 min，利用紫外分光光度计在412 nm处，测定吸光度。同样的方法，配制不同浓度的谷胱甘肽，作标准曲线，得到的标准曲线为：

y=0.3697x-0.0162 R2=0.9976

式中：x为蛋白质质量浓度，mg/mL；y为412 nm处吸光度值。

还原型谷胱甘肽的摩尔质量为307.32 g/mol，因此巯基浓度（mol/L）的计算公式为：

1.3.5 大豆分离蛋白-葡聚糖复合产物接枝度的测定 采用OPA法测定自由氨基 （Cmj等，2003）：OPA 的配制（此试剂现配现用），取 40 mg邻苯二甲醛溶解于1 mL甲醇溶液中，加入20%（m/m）的 SDS（十二烷基硫酸钠)2.5 mL，再加入0.1 mol/L 的硼砂 25.0 mL，加入 100 μL β-巯基乙醇定容至50 mL。

自由氨基的测定：取4.0 mL OPA于试管中，加入200 μL样品，混合均匀，放在35℃的水浴锅中加热，取4.0 mL OPA，加入200 μL水作为空白，在340 nm处测其吸光度。同样的方法，用赖氨酸作标准曲线。由标准曲线计算游离氨基的含量。

1.3.6 复合产物褐变度的测定 取0.1 g样品，溶解于缓冲溶液当中，取1 mL加入5 mL的1%SDS，以缓冲溶液为空白，测定在420 nm处的吸光度值，以吸光度值大小表示样品的褐变程度（Fogliano等，1999）。

1.3.7 起泡性和起泡稳定性的测定 取10 mL待测溶液定容至50 mL，用10000 r/min的速度在高剪切混合头下搅打1 min，将均质后的溶液倒入100 mL量筒中，记下0 min时刻的泡沫体积V1，30 min后记下泡沫体积V2，采用以下公式计算：

1.3.8 乳化性和乳化稳定性的测定 取15 mL待测溶液，加15 mL大豆油于烧杯中，以10000 r/min的速度在高剪切混合头下搅打1 min，在0 min，30 min中在烧杯底部取20 μL样品，与5 mL 0.1%的SDS混合，利用紫外分光光度计在500 nm处，测定其吸光度值（Molina等，2001）：

式中：T=2.303；N为蛋白质稀释倍数；C为待测样品蛋白质浓度，g/mL；o/为乳化液中油相所占体积分数，0.5；A0为 0 min的吸光度值；A30为30 min的吸光度值。

1.3.9 荧光光谱的测定 以290 nm为激发波长，将样品以4000 r/min离心10 min，取0.1 mL上清液定容至10 mL，测定大豆分离蛋白各个样品的内源荧光，双缩脲法测定样品的蛋白质含量。设定激发狭缝宽度：5 nm；发射狭缝狭缝宽度：3 nm；扫描范围：300～ 420 nm；强度范围：0～1000；扫速：中速。

1.3.10 SDS-PAGE的测定 参考Laemmli等（1970）的方法稍作修改，其中分离胶浓度13%，浓缩胶浓度5%。电泳条件：先采用90 V电泳30 min，后采用120 V电泳处理2.5 h。考马斯亮蓝R-250染色，而后脱色拍照。

2 结果与分析

2.1 二硫键打开程度与接枝度结果分析 糖基化反应是通过美拉德反应，其中蛋白质分子游离的氨基与多糖分子的羰基反应，连接到多糖分子的末端。一般采用接枝度，来评价糖基化的反应程度（张晋博，2013）。大豆分离蛋白与葡聚糖的糖基化产物的接枝度，如图1所示，当二硫键打开率为46%时，接枝度明显增加，由此可以断定通过氧化控制性的断开二硫键，可以有效提高糖基化反应的效率。

图1 二硫键的打开程度对接枝度的影响

2.2 褐变度结果分析 糖基化反应的过程中，通常会伴随着褐变现象的发生，产生的物质称为类黑素。其中类黑素是由蛋白质中的氨基酸与糖分子的主干组成的。随着反应的进行，产物的颜色会加深，因此可以通过反应产物的颜色，间接的反映接枝度的大小。因此测定接枝产物的褐变程度，更能直观的反映美拉德反应的程度。如图2所示，褐变程度与接枝度的趋势相符，进一步证明了复合修饰可以提高糖基化效率。

2.3 起泡性以及起泡稳定性结果分析 图3为二硫键的打开程度对起泡性以及起泡稳定性的影响，起泡性依次为 110%、180%、200%、195%、180%、170%，起泡稳定性为 30.77%、45.83%、50.77%、55.56%、57.78%、56.29%。随着二硫键打开程度的增加，起泡性出现先增加后降低的趋势，这是由于二硫键的断开，蛋白质内部的疏水性基团暴露在分子的表面，蛋白质在溶液状态时亲水基团与疏水基团比例接近平衡，蛋白质分子在溶液表面的定向排列更加有序，因此起泡性增加。而随着二硫键断开程度的增加，结构遭到破坏，因此出现降低的趋势。

图2 二硫键打开程度对褐变度的影响

图3 二硫键打开程度对起泡性以及起泡稳定性的影响

如图4所示，起泡性依次为154%、158%、202%、186%、190%、130%，起泡稳定性依次为66.37%、69.34%、71.05%、82.35%、80%、79.5%，与图3比较，起泡性与起泡稳定性有较大的提高。蛋白质与葡聚糖发生糖基化反应，有较高的溶解性，可以比蛋白质以更快的速度转移到分子的界面，以此来提高大豆分离蛋白的表面活性。蛋白质的起泡稳定性主要是由于蛋白质在界面处形成吸附层，稳定了泡沫并且可以防止泡沫的破裂。泡沫的体积随着放置时间的增加而减少，而通过复合修饰后可以明显改善起泡的稳定性。糖基化反应可以改善大豆分离蛋白的发泡能力，降低表面张力，改变样品的溶解度、表面疏水性、泡沫稳定性等。

图4 接枝度对起泡性以及起泡稳定性的影响

2.4 乳化性以及乳化稳定性结果分析 不同程度的打开二硫键，乳化性依次为15.93、25.19、24.73、22.05、23.7、21.44 m2/g，乳化稳定性依次为99.11、140.48、138.44、127.79、132.41、111.33 min（图5）；而复合修饰样品的乳化性依次为33.07、33.52、31.66、26.76、25.01、24.54 m2/g， 乳化稳定性 依 次 为 169、273、474、457、452、236 min （图6），从数值上来看，复合修饰的样品具有更好的乳化性和乳化稳定性。

图5 二硫键打开程度对乳化性以及乳化稳定性的影响

从图6中可以看出，混合物的乳化性和乳化稳定性得到改善，均出现先升高后降低的趋势，当接枝度为19.26%时，乳化性能达到最高为33.52 m2/g，此时的稳定性并非最好，稳定性最高时，乳化性开始下降，这是由蛋白质紧密的三级结构引起的，由荧光光谱分析得到了证实。作为非表面活性剂的亲水性多糖，葡聚糖在空气-水界面上不具备吸附能力，但作为增稠剂或凝胶剂能显著提高蛋白质泡沫的稳定性。如预期的一样，大豆分离蛋白与葡聚糖聚合物的乳化性和发泡性得到改善，打开二硫键使得美拉德反应进一步增强。大多数的疏水性基团和赖氨酸残基被包裹在分子的内部，未折叠蛋白质的赖氨酰残基暴露于外部，相比较折叠的蛋白质有较小的空间位阻，因此容易与多糖中的还原羰基发生反应。Nakamura（1998）等指出，乳化性增加的原因可能是多糖链附着于蛋白质/肽抑制了每个油滴或蛋白质/肽之间的聚集。另一方面，用于糖基化的多糖研究是支链和长链糖类，这提供了更多的空间位阻，预防脂肪小滴的聚结。

图6 接枝度对乳化性以及乳化稳定性的影响

2.5 荧光光谱结果分析 从图7可以看出，天然的大豆分离蛋白在330 nm处，有最大吸收峰。当二硫键断开程度为46%时，峰高最强，发生位移的程度也最大，说明所具有的疏水性程度最高，随着过氧乙酸量的增加，最大吸收峰逐渐变小，可能是由于从蛋白质分子发生聚集，使得发色基团从蛋白质分子的外部迁移到蛋白质分子的内部。图8表明，加入葡聚糖分子后，样品的吸收峰下降明显，并且氧化后样品的吸收峰下降的幅度大于未氧化糖基化样品的吸收峰，并且最大吸收峰发生了蓝移。

由于过氧乙酸的氧化，使得蛋白质分子的结构变得疏松，内部的极性基团暴露出来，因此葡聚糖的加入，更容易发生美拉德反应。随着过氧乙酸浓度的增加，暴露出更多的极性基团，糖基化速率增加，导致了荧光发色基团的猝灭，甚至消失。

图7 二硫键打开程度对内源荧光强度的影响

图8 接枝度对内源荧光强度的影响

2.6 SDS-PAGE结果分析 从图9可以看出，对于未经过过氧乙酸氧化的大豆分离蛋白，AS条带组有三条条带，中间条带颜色较深且较宽。二硫键依次被断开的过程中，AS条带由窄变宽，并且颜色逐渐变深，位置与未经氧化的1比较，上移；说明AS条带存在二硫键，被氧化断开；Band1随氧化过程的增加逐渐出现，Band2随氧化程度增加而逐渐变浅甚至消失。这一现象说明，过氧乙酸的氧化作用强于还原作用，可以将蛋白质分子中的二硫键不同程度上断裂，其次，经氧化后的蛋白质样品条带颜色由浅变深，这意味着在二硫键打开程度较小时亚基发生解离和条带分散，结构变得疏松（卢岩等，2014）。

图9 二硫键打开程度不同SDS凝胶电泳图

从图10中可以看出，为断开二硫键，加入葡聚糖时，对天然大豆分离蛋白样品的条带、种类没有明显的影响，说明葡聚糖对大豆分离蛋白的结构影响甚微。而在氧化的基础上，加入葡聚糖，条带变化比较明显。随着氧化的增加，接枝度增加，A组条带上移，并且条带变宽，说明大豆分离蛋白与葡聚糖反应，生成了新的产物，导致分子量增加；α'和α亚基，在未加入过氧乙酸时，颜色就明显变浅，说明7S中不含二硫键，这与Adachi等（2003）的研究结论相符。因此在未氧化时，7S亚基最先消失，断开二硫键后，11S的酸性亚基，逐渐消失，由此也可以说明过氧乙酸断开二硫键后，可以加速11S酸性亚基与葡聚糖发生糖基化反应。这与Mu等（2011）的报道一致，糖基化反应过程中7S亚基最先消失，其次是11S的酸性亚基，可能是因为11S的碱性亚基含有少量的赖氨酸和精氨酸等。

图10 接枝度不同SDS凝胶电泳图

通过对SDS-PAGE图的分析，一方面证明有大豆分离蛋白与葡聚糖发生了美拉德反应，有糖基化反应的生成；另一方面说明过氧乙酸氧化断开二硫键可以有效提高糖基化反应的速率。

3 结论

大豆蛋白从理论上讲，有良好的表面活性，并且其来源广泛，价格便宜，因此制备大豆蛋白基表面活性剂变得可行。本试验采用过氧乙酸打开蛋白质分子中的二硫键，使得蛋白质发生水解反应，在肽链解旋，重新排列的基础上，引入葡聚糖分子，使其发生糖基化反应，进一步提升大豆分离蛋白的表面活性剂。对其复合产物的乳化性、起泡性以及相对应的稳定性进行了测定，发现表面活性有很大的提升，为制备大豆分离蛋白基表面活性剂奠定了基础。