东北酸菜中乳酸菌的分离鉴定及特性研究

◆作者：李晓颖

◆单位：山东凤凰生物有限公司，山东泰安271000

东北酸菜是我国传统特色的发酵食品。许多学者研究发现东北酸菜中含有多种活性乳酸菌，具有发酵酸菜、产酸、产细菌素的能力。乳酸菌作有助于动物机体内胃肠道正常栖居菌的生长和定植，直接或间接影响其它微生物种群，是一种安全、优质、高效的益生菌，其目前应用于饲料添加剂的乳酸菌主要有植物乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌等。

近年来研究报道，一些乳杆菌类对一些常见抗生素有不同程度耐受性，个别菌株甚至出现了多重耐药性问题。当具有耐药性的菌株以食物形式进入动物机体后，可能会通过基因水平转移等途径将耐药基因传递给其他肠道内生菌或致病菌，从而间接对人类健康造成潜在威胁。目前，筛选对生长性能好、产酸能力强、对抗生素不敏感的的优良菌株尤是益生菌行业发展的重点之一。为此本实验对东北酸菜中产酸性能好的菌株进行了筛选及特性研究，以期获得优良菌株的实验菌株，为乳酸菌在畜禽养殖、食品以及生物制品中的进一步应用提供依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 酸菜样品

实验所用东北酸菜为同事赠予，采自吉林农家自制酸菜。样品采集于灭菌大三角瓶中，封好放入冰盒内，带回实验室于4℃冰箱中保存，尽快进行乳酸菌的扩培及分离。

1.1.2 实验试剂

基因组DNA提取试剂盒、Mixture等购自北京天根生化科技有限公司；溶菌酶购自大连宝生物工程有限公司；猪胆盐购自上海索莱宝生物科技有限公司；改良MRS培养基、LB培养基按常规配方配制，所需其他试剂及溶液均按常规自行配制。

1.1.3 指示菌株

金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均为实验室保存菌株；鸡大肠杆菌O78为山东农大老师赠送。

1.2 实验方法

1.2.1 分菌纯化

取适量的酸菜至100 mL的MRS液体培养基中37℃富集培养20 h，用接种针蘸取培养液在含CaCO3的MRS固体培养基划线，37℃恒温静置培养48 h后，挑取培养基上具有明显透明圈的单菌落，接种在斜面上培养，然后进行革兰氏染色、镜检。

1.2.2 菌株鉴定

目的菌株接种于新鲜的MRS培养基中培养20 h，按照北京天根“细菌基因组DNA提取试剂盒”说明书提取菌体DNA，采用通用引物，并以其为模板扩增16S rDNA基因组序列。将PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定，将获得16S rDNA基因序列在NCBI进行 BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对。

1.2.3 产酸及抑菌能力测定

将目的菌株种子液以2%接种量接种到初始pH值一致的MRS培养基中，37℃静置培养20 h后，测定发酵液的pH值。将纯菌培养液以4000 r/min离心30 min，取其上清液，采用牛津杯法进行抑菌试验。

1.2.4 耐酸耐胆盐能力测定

菌株活化2代后的液体培养物按2%的接种量接种于pH=3的灭菌 PBS中，37℃培养。分别于1、2 h取菌悬液，进行平板菌落计数，计算乳酸菌的存活率，以pH 5.5～6.0的菌液为对照。同时按2%的接种量接种于胆盐浓度为0.3%（w/v）的MRS培养基中，以不加胆盐的MRS培养基为对照，37℃培养，分别于1、2 h取菌悬液，进行平板菌落计数，计算乳酸菌存活率。

1.2.5 抗生素耐药谱测定

将纯化的菌体划线取单菌落，悬于3 mL生理盐水中，调整菌体浊度为0.5麦氏单位。用无菌棉签均匀涂布MRS培养基表面，用灭菌镊子取药敏纸片贴于培养基表面。培养18～24 h后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.2.6 生长曲线

将鉴定后所需菌株发酵液以4%接种量接种到于改良的MRS培养基中，37℃静置培养，于 0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h取样测定pH值以及活菌数，以培养时间为横坐标，相应的活菌数的对数值为纵坐标，绘制生长曲线。

2 实验结果及分析

2.1 酸菜中菌株分离纯化及鉴定结果

5株菌的16S rDNA PCR电泳图如图1所示，条带在1000～2000bp之间，约为1500bp。

图1 菌株PCR扩增产物琼脂凝胶电泳结果

将 5 株 菌 DB-1、DB-2、DB-3、DB-4、DB-5 的 16S rDNA在NCBI中进行BLAST序列比对，结果显示：DB-1、DB-4、DB-5的16S rDNA基因序列与植物乳杆菌Lactobacillus plantarum有较高的同源性（100%）；DB-2、DB-3的 16S rDNA 基因序列与棒状乳杆菌Lactobacillus coryniformis有较高的同源性（100%）。鉴于棒状乳杆菌还未允许应用于饲料行业中应用，后期只进行植物乳杆菌的特性研究。

2.2 产酸及抑菌能力测定

3株植物乳杆菌发酵液的pH及抑菌实验结果如表1所示。

由表1可以看出，不同菌株发酵后的培养液pH有一定的差异，3株菌株对大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌均有明显的抑制效果，其对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑制效果好于对沙门氏菌的抑制效果。

2.3 耐酸耐胆盐能力测定

3株植物乳杆菌发酵后活菌数及耐酸耐胆盐能力如表2所示。

通过表2看出，3株植物乳杆菌的耐酸能力较强，2h内的存活率均高于94%，其中DB-5的耐酸能力最强，2h的存活率为98.9%；耐胆盐能力相对较弱，2h内存活率最高的为 DB-1，为55.8%。

2.4 抗生素耐药谱测定

3株植物乳杆菌对不同抗生素的药敏圈直径结果如表3所示。

表1 3株植物乳杆菌发酵液产酸及抑菌能力(单位：mm)

表2 3株植物乳杆菌发酵后活菌数及耐酸耐胆盐测定结果

表3 3株植物乳杆菌对6抗生素敏感性测定结果(单位：mm)

通过测定3株植物乳杆菌对6种抗生素的敏感性，结果显示：3株植物乳杆菌均对万古霉素具有耐药性；其中仅有DB-5对青霉素具有抗性，另外两株则具有很好的敏感性。结合3株菌的产酸、抑菌、生长特性、耐酸耐胆盐能力综合考虑保留DB-1进行后期生长曲线摸索。

2.5 DB-1生长曲线测定

通过测定不同时间段的pH及活菌数，所绘制生长曲线如图2所示。

图2 DB-1实验室生长曲线

由图可以看出，在0-10 h内菌体生长迅速，在4h左右进入对数期，随后进入稳定期，且持续时间较长，并在12 h时活菌数达到最大值1.9×109CFU/mL，后期进入稳定期，到28h，活菌数下降不明显，菌体一直处于稳定期内。

3 结论与讨论

微生态制剂包含益生菌及其代谢物和促生长物质，具有协调、维持人和动物机体的微生态平衡的作用。其代谢物如：酶、维生素等物质能促进动物营养吸收及生长发育。目前微生态制剂在畜牧养殖业中已有较多的应用，在增加动物机体体重，提高免疫力方面发挥了很好的功效。尹清强（2014）研究发现饲喂复合微生态制剂，能增加胃肠道内乳酸菌的数量，降低大肠杆菌的数目，提高其免疫球蛋白的数量。杨龙龙（2014）分离获得的乳酸菌能显著抑制大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的增长，可降低奶牛的腹泻率，提高其免疫力及增重。

益生菌经口服进入动物机体，必须先经过胃然后到小肠定植，因此益生菌只有能够抵抗较强的酸性环境和较高浓度的胆盐才能使其在肠道中存活和正常发挥作用。从东北酸菜中分离出5株菌株，经分子鉴定DB-1、DB-4、DB-5为植物乳杆菌，DB-2和DB-3为棒状乳杆菌，后期仅对3株植物乳杆菌进行特性研究。通过测定3株植物乳杆菌的产酸、抑菌、活菌数及对抗生素的敏感性，筛选出特性较好的株DB-1。该菌在在pH值为3的条件下，2h的存活率为98.2%；0.3%胆盐浓度下2h的存活率为55.8%，说明该菌株具有较强的耐酸和耐胆盐能力。对鸡大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的抑菌结果显示：该菌对3种致病菌的抑菌结果较好，尤其是对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力显著。通过测定该菌的生长曲线显示：该菌生长较快，在4 h左右进入对数期，12 h时活菌数达到最大值1.9×109CFU/mL，随后进入稳定期，且持续时间较长，可作为优良的益生菌候选菌。

许多研究者都指出，商用乳酸菌若不经过严格的安全性筛选，后期应用过程中很可能会担当耐药性基因贮存宿主的角色。石磊等（2014）通过检测不同品牌酸奶的菌株对抗生素的耐受性，发现所有菌株均出现多重耐受性；马沁沁等（2015）研究发现四川地区人肠道及发酵食品中的52株乳杆菌，60%以上的菌株分别对诺氟沙星、万古霉素、红霉素和环丙沙星具有耐药性。随着生活水平的不断改善，消费者对畜禽产品的质量要求越来越高，欧盟已经采取了抗生素相关限用、禁用政策，同时分析乳酸菌对不同抗生素药物的敏感性，能帮助了解不同抗生素对乳酸菌的影响，为产品的日常合理应用提供参考。

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是我国卫生部公布的《可用于生产普通食品的菌种名单》中的菌种，因此本研究所获得的DB-1具有作为益生菌的良好潜质，亦可用于食品中。筛选安全且对机体有效的乳酸菌，并实验现工业化大生产，是益生菌行业发展的重点方向之一，相信随着我国养殖业的发展，微生态制剂作为新型的饲料添加剂将有更加广阔的应用前景

参考文献：（略）