植物精油与硫酸粘杆菌素对不同菌株抗耐药性研究

◆作者：张修坤 吕勇 沈兆艳 吴世林

◆单位：广州智特奇生物科技股份有限公司，广东广州510000

抗生素可通过非选择性抑菌或杀菌，消除肠道有害微生物对动物生长的抑制作用（吴迪等，2010）。抗生素应用在畜禽生产中，可避免因幼仔免疫力不足、消化系统发育不健全而带来的健康问题，从而降低幼仔的发病率和死亡率（魏磊等，2016）。但是细菌的耐药性目前正受到公众越来越多的关注，随着抗生素被滥用和可对多种抗生素产生耐药性的“超级细菌”的不断出现，细菌的耐药性所产生的危害越来越明显，且很难被控制（韩飞等，2016）。尤其是在畜牧生产方面，抗生素的副作用已经严重威胁到了消费者的健康和生命安全。细菌耐药性这一问题的解决有很多途径，但是研发新的抑菌剂是非常有效的一个方法（贾爱卿等，2006）。植物提取物因其具有抑菌、灭菌、易被消化分解等优点，而被作为新型饲料添加剂的研究热点（CHANG等，2001）。

植物精油可作为抗生素的替代品用于畜禽业生产，采用合理的试验方法评估验证植物精油的抗耐药性，对改进和推广植物精油产品是十分必要的。本实验利用琼脂平板法来测定植物精油与硫酸粘杆菌素对不同世代、不同分离源的野生大肠杆菌和乳酸菌的最低抑菌浓度，比较植物精油与硫酸粘杆菌素的抗耐药性。

1 试验材料

1.1 抗生素和植物精油

硫酸粘杆菌素为市场中所购，含量为10%，植物精油（智然香，3.5%）由广州智特奇生物科技股份有限公司提供。

1.2 供试菌种

野生型的大肠杆菌、乳酸菌，由本实验室分离保存；标准型肠杆菌、乳酸菌，购买自广东省微生物研究所。

1.3 仪器

恒温恒湿箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-IG型单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；DHG-924OA电热恒温鼓风干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司；不锈钢手提式蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；FA2004电子天平 (感量0.0001 g)：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；培养皿、试管、移液枪、接种环等。

1.4 培养基

MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉粉膏5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖 20.0g，吐温 80 1.0mL，磷酸氢二钾 2.0g，乙酸钠 5.0g，柠檬酸三铵 2.0g，硫酸镁 0.2g，硫酸锰 0.05g，琼脂粉 15.0g，蒸馏水1000mL，将上述成分加人蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.8，分装后121℃高压灭菌15～20min。

营养琼脂培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂 15.0g，将上述成分加人蒸馏水中，加热溶解，校正pH 7.1～7.5，分装后121℃高压灭菌15 ～20 min。

伊红美蓝培养基：蛋白胨10.0g，乳糖 10.0g，磷酸氢二钾2.0g，琼脂 20～30g，蒸馏水1000mL，l2%伊红水溶液20mL，0.5%美蓝水溶液13 mL，pH 7.3。

2 方法

2.1 菌株的分离

收集仔猪的新鲜粪便，加入已灭菌并冷却的蒸馏水进行稀释，将不同梯度的稀释液接种于伊红美蓝琼脂培养基和MRS鉴别培养基，进行初步筛选。当有肉眼可观察的菌落出现后，用接种针挑取符合要求的菌落，然后进行生化试验进行菌种鉴定（王红宁等，2000）。

2.2 菌悬液的配制

将鉴定后的野生型菌株和实验室保存的标准型菌株接种至已灭菌并冷却的缓冲蛋白胨水液体培养基和MRS液体培养基中，培养。分别吸取以上供试菌液0.5 mL，加入无菌水倍比稀释到 105～106cfu/mL，备用。

2.3 植物精油与硫酸粘杆菌素最低抑菌浓度的测定

用琼脂平板法测定各植物精油与硫酸粘杆菌素的最低抑菌浓度（MIC）；稀释植物精油与硫酸粘杆菌素，用移液枪吸取各稀释液0.5 mL，加入培养皿中，再加入灭菌完毕并冷却至50℃左右的培养基，振荡混合，静置，植物精油浓度为1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%，硫酸粘杆菌素浓度为0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%，每组3个平行。待培养基凝固后，利用涂布棒将菌液涂布均匀。倒置于35℃培养箱中培养。48 h后，观察测试菌种的生长情况，完全无菌落生长时的最低浓度即为MIC值。

3 结果与分析

3.1 植物精油与硫酸粘杆菌素对不同世代的野生型菌株的最低抑菌浓度和效价比

植物精油与硫酸粘杆菌素对不同世代野生型菌株的最低抑菌浓度测定结果见表1。从表1中可以看出，植物精油与硫酸粘杆菌素对第1代野生型大肠杆菌的最低抑菌浓度分别为2%、1.8%，效价比为1.1∶1；对第3代野生型大肠杆菌的最低抑菌浓度分别为2.1%和2.7%，效价比约为0.8∶1。植物精油与硫酸粘杆菌素对第1代野生型乳酸菌的最低抑菌浓度分别为2.2%和0.8%，效价比约为2.8∶1；植物精油与硫酸粘杆菌素对第3代野生型乳酸菌的最低抑菌浓度分别为2.2%和1.5%，效价比约为1.5∶1。

表1 植物精油与硫酸粘杆菌素对不同世代的野生型菌株的最低抑菌浓度

表2 植物精油与硫酸粘杆菌素对不同分离源菌株的最低抑菌浓度

3.2 植物精油与硫酸粘杆菌素对不同分离源的菌株的最低抑菌浓度和效价比

植物精油与硫酸粘杆菌素对不同分离源的菌株的最低抑菌浓度见表2。由表2可知，植物精油与硫酸粘杆菌素对标准型大肠杆菌的最低抑菌浓度分别为2.2%和0.1%，效价比为22∶1；对野生型大肠杆菌的最低抑菌浓度分别为2.0%和1.8%，效价比约为1.1∶1；植物精油与硫酸粘杆菌素对标准型乳酸菌的最低抑菌浓度分别为2.2%和0.08%，效价比约为28∶1；植物精油与硫酸粘杆菌素对野生型乳酸菌的最低抑菌浓度分别为2.2%和0.8%，效价比约为2.8∶1。

4 结论

综上所述，植物精油与硫酸粘杆菌素的效价比随着世代的不同、分离源的不同而差异较大。硫酸粘杆菌素对野生型大肠杆菌和乳酸菌的抗耐受性较弱，随着培养时间的增加，必须提高硫酸粘杆菌素的添加量才能达到一样的抑制效果；而植物精油对野生型大肠杆菌和乳酸菌的抗耐受性较强，随着培养时间的增加，植物精油的添加量几乎没有变化。对不同分离源的菌株，植物精油也表现的较为稳定，而硫酸粘杆菌素则变化较大。这可能是由于植物精油中活性物质的抑菌机理是直接作用于细菌的细胞膜，使其通透性产生变化，破坏其生物结构提高细菌的敏感度，而这种抑菌方式很难产生耐药性（Bouhdidetal.，2009）。因此，植物精油（智然香）作为抗生素替代品，具有很好的推广前景。

参考文献：（略）