1 875例孕妇产前遗传学诊断结果与产前诊断指征分析

龙喜贵 覃婷 莫伟英 伍欣 张鹏 田矛

广西壮族自治区人民医院产前诊断中心（南宁530021）

产前诊断是预防出生缺陷的主要手段。目前，国内外针对产前诊断中胎儿染色体异常/畸变检测以G 显带核型分析、拷贝数变异（copy number variation，CNV）检测及快速产前检测，如荧光定量PCR（QF-PCR）及荧光原位杂交技术（FISH）检测为主。G 显带核型分析是目前产前诊断细胞遗传学检测的金标准，但对5～10 Mb 以下的小片段的染色体CNV 缺乏诊断能力。全基因组拷贝数变异检测（CNV-sequencing，CNV-seq）可检测染色体非整倍体以及100 kb 以上CNV 导致的疾病，但不能检测染色体易位及倒位等平衡变异。美国妇产科医师学会（ACOG）已推荐其可作为胎儿结构异常时诊断评估的一线检测方法［1］。FISH［2］及QF-PCR［3］通常只作为对胎儿常见染色体（13、18、21、X、Y）的非整倍体快速筛查。本研究通过联合应用需细胞培养的染色体核型分析及不需细胞培养的高通量测序CNV-seq，探讨了1 875例胎儿中不同产前诊断指征、不同取材及不同检测方法下的染色体异常检出率及差异，特别比较及讨论了两种方法在诊断染色体嵌合体上的差异及处理原则。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集自2016年1月至2018年8月因不良孕产史、高龄、单基因病携带、母血清筛查高风险、母血中胎儿游离DNA 检测（non-invasive prenatal test，NIPT）高风险、超声软指标异常［如胎儿颈部透明带（nuchal translucency，NT）增厚、鼻骨缺失、肠管回声增强、侧脑室临界、肾盂轻度分离等］、超声胎儿结构异常、胎儿生长受限（fetal growth restriction，FGR）、附属物异常等高危因素作为产前诊断指征，接受侵入性产前诊断取材，取材培养成功的产前诊断标本共1 875例，其中根据不同孕周，分别进行经腹绒毛活检169例、羊水取材1 435例、脐静脉取样271例。

1.2 研究方法羊水穿刺、脐带血穿刺及绒毛活检3种取材均在超声定位引导下进行。染色体核型分析由我院细胞遗传实验室完成，取材后进行细胞培养、收获、制片及G 显带核型分析，使用Zeiss AxioImagerZ2 全自动染色体遗传分析系统（德国），显微镜下观察并计数20个分裂象，分析5个核型，发现异常核型后则加大计数至50～100个细胞；CNV-seq 外送至湖南家辉遗传专科医院，使用Illumina NEXT SEQ CN500 高通量测序仪（中国），通过二代测序法检测。全部结果经汇总产前诊断指征、超声结果、染色体核型及CNV 结果等信息进行分析。染色体核型分析根据人类细胞遗传学国际命名体系（ISCN2016）进行命名，CNV 致病性判读根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）诊断标准进行。侵入性产前诊断取材，送检检测方法均遵守广西壮族自治区人民医院医学伦理学委员会的要求，所有孕妇术前常规进行咨询并签署知情同意书，结果出具后复诊及咨询。

2 结果

2.1 染色体及CNV 异常检出率1 875例接受产前诊断的孕妇中，总共确诊致病性染色体和致病性CNV 179例，异常检出率9.55%。其中单独致病性染色体检出159例，异常检出率8.48%（159/1 875）。检出染色体多态88例（4.69%），染色体平衡易位10例（0.53%）；单独致病性CNV 检出144例，异常检出率7.68%（144/1 875）。同时，检出意义不明CNV 82例（4.37%），多态性CNV 89例（4.75%）。见表1。

表1 1 875例产前诊断胎儿染色体及CNV 异常与多态检出率Tab.1 The detection rates of chromosome and CNV abnormalities and polymorphisms in 1 875 prenatal diagnosis fetuses

2.2 各高危指征异常检出率各指征中，NIPT 高危、胎儿心脏异常、胎儿NT 增厚和鼻骨缺失的异常检出率较高，分别为10.71%（3/28）、41.57%（37/89）、19.72%（14/71）、26.89%（32/119）及15.38%（6/39）。此外，高龄、单脐动脉、羊水异常及IVFET 术后异常检出率分别为7.69%（64/832）、13.04%（6/46）、7.89%（3/38）及8.22%（6/73）。见表2。

2.3 染色体正常核型及多态性核型中不同CNV的检出情况90例染色体多态性核型的胎儿中，CNV-seq 发现2例致病性（2.22%）及8例临床意义不明CNV（8.89%）；1 624例染色体核型正常的胎儿中，CNV-seq 检出16例致病性CNV（0.99%）及74例临床意义不明CNV（4.56%）。见表3。

2.4 两种检测方法对染色体嵌合的检出情况共检出异常染色体嵌合状况16例，其中2例染色体核型分析正常，但CNV 检测发现1例为18 三体嵌合，1例为X 染色体单体嵌合，嵌合比例约占1/3；2例CNV 检测未见异常，但染色体核型发现X 单体嵌合。其余12例嵌合情况一致，但嵌合比例存在差异。见表4。

2.5 染色体三体及性染色体异常核型检测率3种取材染色体核型分析及CNV-seq 共检出常见染色体三体/及性染色体异常127例，包括6例13-三体、28例18-三体、51例21-三体、12例45，X、6例47，XXX、7例47，XXY 及4例47，XYY等，检出率为6.77%（127/1 875）。见表5。

表2 各高危指征及异常检出率Tab.2 The detection rates of high-risk indications

表3 正常及多态染色体核型中不同CNV的检出情况Tab.3 The detection of different CNVs in normal and polymorphic karyotypes 例（%）

3 讨论

产前诊断是防控出生缺陷的有力举措。通常，除部分明显的胎儿畸形或结构异常可通过超声等得以诊断外，大部分需通过侵入性取材进行产前诊断以避免缺陷患儿出生。本研究回顾性分析了1875例有产前诊断指征的孕妇在超声引导下，根据孕妇情况及孕周分别选择绒毛活检、羊膜腔穿刺或脐带血穿刺，取材后行胎儿染色体核型分析和/或CNV-seq 检测，比较了不同指征的胎儿染色体异常检出率。

与传统的细胞遗传学分析相比，超声检查发现胎儿畸形的情况下行CNV 检测可提高致病性CNV 或临床意义不明CNV的检出水平［1，4］。在一项针对1 033例超声提示胎儿畸形的研究中，致病性CNV的检出率为5.5%［5］。本研究中，总的异常检出率9.55%。其中单独染色体核型异常检出率为8.48%，单独致病性CNV 异常检出率为7.68%。减去染色体核型分析能发现的异常外，CNV-seq 可额外发现约1.07%的异常（微缺失、微重复），与报道类似［6］，说明染色体核型分析联合CNV-seq技术一定程度上提高了异常检出率，可为遗传咨询及再发风险评估提供更多的依据。但需进行检测前咨询或产前诊断前咨询，从而使患者有机会了解CNV检测技术的益处及局限性，并根据他们的个人信仰和实际情况做出是否进行检测的决策［7-8］。本研究中常见的指征是高龄，占总穿刺人数的44.37%，可能与目前生育年龄整体偏晚及“二孩”政策开放有关，异常检出率为7.69%，与国内研究［9］结论相近。其次为不良孕产史和母血清学筛查高危等，这可能与生育观念改变及血清学筛查的常规应用有关。

表4 染色体核型嵌合检出情况Tab.4 The detection of chromosome mosaics

表5 染色体三体及性染色体异常核型检出率Tab.5 The detection rates of autosomal trisomy and sex chromosome anomalies

NIPT 因常见染色体非整倍体近100%的敏感性和特异性使其成为快速应用的基因检测之一。本研究中，NIPT 总体高危的染色体异常检出率最高，说明了NIPT技术的阳性预测值较高，展示了NIPT 良好的应用前景。但尚有不少比例为假阳性，这与我们分析统计时将NIPT 提示性染色体异常及相关附加提示（其他染色体或CNV 异常）都包括在内有关，这提示我们NIPT 高危后进一步行产前诊断的必要性。最近一项针对2 779个胎儿的研究发现，报告异常的CNV 结果中约有50%无法通过标准NIPT 检测到（即不涉及21、18、13-三体，X 单体或性染色体三体）［10］。造成NIPT 结果不一致的原因众多，限制性胎盘嵌合体、母体CNV、双胎之一消失、母体癌症及真正的胎儿嵌合等是最常见的原因［11］。NT 增厚与染色体核型异常、胎儿先天性心脏病及其他结构畸形高度相关，当NT 厚度≥3.0 mm，胎儿致病性CNV 检出率可达7.69%［12］。本研究中NT 增厚的异常检出率为26.89%，异常检出率较高，可能与样本数较少及计算时包括了染色体异常有关。ACMG 对CNV 评估及临床解读是根据CNV 是否相邻或位于已知综合征区域，CNV 涉及区域内的基因及其突变的性质与大小等进行。根据此CNV的判读原则，本研究在1 714例染色体多态或正常的孕妇中检出18例致病性CNV，说明CNV-seq技术具有更高的灵敏度和特异性。有研究认为年龄小于36岁的孕妇患致病性CNV的风险高于唐氏综合征［13］。这说明不管高龄与否，常规开展CNV-seq 检测具有必要性。本研究意义不明CNV 检出率较高，可能本研究中样本来源皆为具有产前诊断指征的高危孕妇有关。检测中发现的临床意义不明CNV 因报道的变异与表型之间的相关性或证据不足，无法有效将变异与胎儿的异常表型进行关联。这些临床意义不明CNV 给临床诊断及遗传咨询带来了不小压力。对于新发的临床意义不明CNV，ACMG 建议对患者出生后进行随访［14］。

研究表明［15］胚胎分裂期嵌合率约为15%～90%。相对于常规核型分析，CNV-seq 不需要细胞培养，对分裂期及未分裂期细胞均可检测。本研究发现16例染色体嵌合体异常，其中2例染色体核型检测正常，但CNV 检测发现1例为18-三体嵌合，1例为X 染色体单体嵌合，可能与核型细胞培养过程中，正常细胞相对异常细胞具有生长优势，经过培养后嵌合情况往往会降低不容易被检出有关，同时，发现2例CNV-seq 检测未见异常，但染色体核型分析发现为X 单体嵌合，这可能与离体培养时异常细胞得到扩增或母体细胞污染有关。其余12例嵌合情况一致，但嵌合比例存在差异。这提示因不同方法灵敏度及是否经过培养等差异，检测的嵌合比例不可避免存在差异。通常，CNV-seq技术对嵌合体的诊断相对于核型分析具有更高的准确性和真实性，这提示笔者在遇到产前诊断嵌合的情况时，需结合超声及多个平台的结果进行综合评价，并建立特殊病例讨论制度。做到“准确”诊断，有效咨询。21、18、13-三体及性染色体非整倍体是导致出生缺陷的常见原因。本研究中，三种取材共检出常见染色体三体/及性染色体异常127例，检出率为6.77%。21、18、13-三体总计85例，以21-三体最多，占60%。这提示我们对常见三体综合征及性染色体异常的产前诊断工作依然是重点，需谨慎全面，诊断有力有效。

综上所述，本研究通过联合应用染色体核型分析及CNV-seq技术，较为详细地阐述了不同指标及不同方法下异常染色体的检出率，特别分析了两种方法对染色体嵌合体的检出比例差异，有效改善了产前诊断的准确性，阻断了异常胎儿的出生。但检出的众多临床意义不明CNV 使得产前诊断的临床咨询更具复杂性及挑战性。本研究的不足在于样本量偏小，部分指标的分析易受样本量的影响。随着进一步诊断及研究，样本量增大后这一问题将得到解决。鉴于染色体平衡易位通常不产生病理表型，是否平衡易位核型胎儿不需要进行产前诊断选择？在常规染色体核型分析不能诊断平衡易位产生的断裂或融合致病基因的前提下，G 显带核型分析是否逐渐失去了检测的意义？是否可完全被CNV 检测取代？随着技术的不断发展终将得到解决。