冷星宇 俞勤斐 周凡 沈薇 孟晓静 吴娴波 覃旻 范宏英
1南方医科大学公共卫生学院(广州510515);2毕节市第三人民医院(贵州毕节551500);3南方医科大学南方医院新生儿科(广州510515)
铅是一种广泛存在于生活环境和职业环境中的有毒重金属[1],可通过呼吸道、消化道和皮肤等途径进入机体内,损伤神经、造血、消化道和生殖等多个系统[2-6]。而长期暴露于高铅环境,将严重影响人体健康,尤其对儿童的神经系统的影响更为显著[7]。发育期铅神经毒性的突出特点是铅暴露可通过胎盘和血脑屏障,影响海马突触功能,导致学习记忆和认知功能下降[8]。目前,对于铅中毒的治疗多采用金属络合剂,如依地酸二钠钙、2,3-二巯基丁二酸,研究证明,金属络合剂会产生持续的胃肠道不良反应、“过络合综合征”、肝肾毒性等毒副作用,并且不适用于孕妇、哺乳期妇女及儿童[9-11]。因此,需要寻找新的方法或制剂防治这类人群的铅中毒。
近年来,利用微生物吸附环境中有毒、有害物质被广泛关注并初具成效[12-13]。受此启发,国内外专家着力开发肠道益生菌吸附重金属的潜能。人体肠道益生菌主要包括乳杆菌、双歧杆菌与部分革兰阳性球菌等,具有维持肠道稳态、调节免疫功能、抗氧化、抗肿瘤等多种生理功能[14-15]。GIRI等[16]报道对铅暴露的鲤鱼给予来源人肠道的罗伊氏乳杆菌P16(Lactobacillus reuteri P16)干预,可以减少铅在鱼体内的蓄积,同时可改善铅所致的造血功能紊乱。此外,一项对坦桑尼亚地区的孕妇和儿童的干预研究表明,食用益生菌L.rhamnosus GR-1 发酵的酸奶可降低孕妇体内的汞和砷等有毒重金属的水平,首次证明乳酸菌能降低人血液中重金属浓度[17]。
鼠李糖乳杆菌GG株(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)是一株从人类肠道分离的乳杆菌,具有肠道黏附率高,定植力强,能降低体内胆固醇水平、调节免疫功能等益生功能[18]。但目前还没有发现LGG 能否在防治铅中毒中发挥作用,为此,本研究通过建立孕期及哺乳期铅暴露模型,研究LGG 对仔鼠血液、大脑、骨骼及肾脏中的铅蓄积的影响,并观察LGG 对铅导致的肝脏氧化、脑部和肠道病理损伤的保护作用,对防治发育期幼儿铅中毒,促进我国儿童健康具有重要意义。
1.1 菌种与培养基LGG(ATCC53103)由美国南加州大学黄胜和教授馈赠。37 ℃培养于MRS 培养基(广东环凯微生物科技有限公司)。
1.2 主要试剂醋酸铅为分析纯,购于生工生物工程(上海)股份有限公司;谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)等检测试剂盒,购于南京建成生物工程研究所。
1.3 动物实验6 周龄SPF 级C57BL/6 鼠24 只,其中雄鼠、雌鼠各12 只,购于广东省医学实验动物中心(许可证号:SCXK(粤)2013-0002)。适应性喂养1 周(室温维持在22~25 ℃,昼夜循环为12 h,普通喂养,饮用无菌水),按雌雄比1∶1 将小鼠随机分为4 组,动物实验分组及处理方法见表1。
表1 动物实验分组及处理Tab.1 Animal experimental protocol
待雌鼠怀孕后,分笼喂养,各组处理方法不变,直至实验结束。记录各仔鼠出生时间,21日龄时,0.5%戊巴比妥钠50 mg/100 g 体质量麻醉处死,收集全血、胸骨、左股骨、肾、肝、肠和脑,所有样本保存于固定液或-20 ℃冰箱。本研究获得南方医科大学动物伦理委员会批准及监督,整个研究过程符合动物伦理学要求(伦理批准文号:L2015029)。
1.4 体质量及脏器系数测量仔鼠处死前,称量并记录各仔鼠体质量。脑、肝、肾等脏器取样后,吸水纸吸干脏器表面水分,称重,计算脏器系数:脏器指数=器官湿重(mg)/体质量(g)。
1.5 组织铅含量测定血铅测定:10 μL 全血稀释于990 μL 血液稀释液(0.1%Triton-×100、1%浓硝酸用去离子水稀释),震荡30 s,电感耦合等离子体质谱(ICP_MS)法检测铅浓度。检测分析条件为:等离子体流15 L/min,雾化气流速0.8 L/min,辅助气流速0.2 L/min,RF 功率1 100 W,等离子体观测方向为轴向,进样流速1.5 mL/min。
组织铅测定:骨、脑、肾组织80 ℃烘烤4 h,精确称取0.05 g;加3 mL 浓硝酸,2 mL 过氧化氢微波消解,设置消解程序(升温1∶1 200 W,5 min,120 ℃维持3 min;升温2∶1 200 W,5 min,150 ℃维持5 min;消化:1 200 W,3 min,180 ℃维持10 min;降温:15 min)[22]。消解后,去离子水定容至50 mL,同上ICP_MS 法测铅浓度:组织铅浓度(μg/g)=样本铅液浓度×50/组织重量。
1.6 氧化应激因子检测称取肝脏1.0 g,加入生理盐水9.0 mL,冰上研磨制成10%的组织匀浆,3 000 r/min 离心10 min,收集上清液。BCA 蛋白浓度检测试剂盒检测各样本蛋白浓度,按GSH-Px、SOD、NO等试剂盒说明书检测各氧化应激因子活力。
1.7 小肠、脑组织病理切片取小肠及脑组织于10%多聚甲醛固定2 d,脱水、石蜡包埋后切制成5 μm的切片,苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察小肠及脑的病理变化。
1.8 统计学方法应用SPSS 19.0 软件进行数据处理,各组数据以均数±标准差表示,采用单因素方差分析法对结果进行处理,方差齐时,采用LSD法进行两两比较;方差不齐时,采用SNK 法进行两两比较,P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1 子代鼠体质量、脏器系数测定子代鼠体质量及脏器系数,结果显示(图1),Pb 组子代鼠体质量与肝、脑的脏器系数均低于NC 组,差异均有统计学意义(P<0.05),肾的脏器系数高于NC 组(P<0.05);与Pb 组相比,LGG.Pb 组的体质量、肝、脑的脏器系数升高(P<0.05),说明LGG 干预铅暴露母鼠可改善子代鼠体质量减轻及铅对肝、脑等重要器官的综合损伤作用。
2.2 子代鼠各组织铅浓度检测子代鼠血铅、脑铅、骨铅和肾铅浓度,结果显示(图2),与NC 组相比,Pb 组子代鼠的血铅、脑铅、骨铅、肾铅浓度均显著升高(P<0.05);LGG.Pb 组子代鼠的血铅、脑铅、骨铅、肾铅浓度降低(P<0.05),说明LGG 干预铅暴露母鼠可减少铅在子代鼠血、脑、骨和肾等组织器官的蓄积。
图1 各组子代鼠体质量与重要脏器系数Fig.1 The weight and the organ coefficient of offspring
图2 各组子代鼠组织器官铅浓度Fig.2 The concentration of Pb in offspring′s tissues or organs
2.3 肝脏氧化应激相关因子活性检测子代鼠肝脏氧化应激水平,结果显示(图3),与NC 组相比,Pb 组子代鼠肝脏中GSH、GSH-Px、SOD等活性降低、NO 水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与Pb 组相比,LGG.Pb 组子代鼠GSH、GSH-Px 及SOD 活性升高(P<0.05),而NO 水平降低(P<0.05)。说明LGG 干预铅暴露母鼠可增强子代鼠肝脏的抗氧化酶活性,降低铅所致的氧化应激分子水平,以减轻铅中毒所致的氧化应激损伤。
2.4 肠组织病理结果对子代鼠小肠进行HE 染色,结果显示(图4),Pb 组子代鼠小肠病理损伤严重,肠上皮细胞的标志性空泡消失、排列疏松,胞核移动至胞质中间,无极性;杯状细胞体积变小、数量减少;小肠腺萎缩;中央乳糜管变窄甚至消失。LGG.Pb 组小肠的病理损伤减轻,肠上皮细胞排列紧密,胞核极性正常;杯状细胞及中央乳糜管形态恢复正常。提示LGG 干预后,母鼠铅暴露致铅中毒子代鼠的小肠病理损伤得到有效改善。
图3 各组子代鼠肝脏氧化应激相关因子活性Fig.3 The activities of oxidative stress related factors in offspring′s liver
图4 各组子代鼠小肠的HE 染色(×200)Fig.4 The HE staining of offspring′s small intestine(×200)
2.5 脑组织病理结果对子代鼠脑组织进行HE染色,结果显示(图5),Pb 组子代鼠大脑皮层有明显的病理损伤:出现弥漫性神经元固缩、星形胶质细胞增生水肿等病理损伤,并有不同程度的神经元坏死现象。LGG.Pb 组的病理损伤有所恢复,大脑皮层细胞排列紧密,小胶质细胞和星形胶质细胞增生、水肿情况明显减少,少有神经元细胞坏死。说明,LGG 干预铅暴露母鼠可缓解子代鼠大脑皮层的病理损伤。
图5 各组子代鼠大脑的HE 染色(×100,×400)Fig.5 The HE staining of offspring′s brain(×100,×400)
铅是一种稳定的重金属,由于其特殊的理化性质,广泛应用于现代工业,同时也是大部分化妆品、日用品不可缺少的成分[2,4]。人们通过各种途径接触铅,经口摄入并由胃肠道暴露铅是目前生活环境中慢性铅中毒的主要途径之一[23]。大量研究表明,铅可引起人体多个系统损伤并造成远期影响,但孕期至哺乳期妇女暴露铅会引起婴儿何种变化至今鲜有报道[24]。本研究发现,母鼠经饮水进行铅暴露,子代鼠的大脑、骨骼和肾脏等重要组织的铅水平均升高,且血铅水平达到600 μg/L以上(图1),说明孕期及哺乳期母鼠铅暴露可导致子代小鼠发生铅中毒。
益生菌能定植于人体肠道并产生确切的健康效益,借鉴利用微生物吸附环境有害物质的经验[12-13],国内外研究人员广泛关注其吸附重金属的潜能,TEEMU等[21]发现,鼠李糖乳杆菌GG 具有吸附污水中铅、镉、汞等有毒重金属的能力。本研究在上述动物模型基础上,使用109CFU的LGG 对母鼠进行灌胃干预,探讨LGG 对母鼠暴露铅致子代鼠铅中毒的保护作用,结果显示,经LGG 干预铅暴露母鼠后,铅中毒子代鼠体质量及肝、脑的脏器指数升高(图1),血铅、脑铅、骨铅和肾铅等组织铅浓度降低(图2),表明LGG 干预铅暴露母鼠能通过降低铅在子代鼠体内的蓄积量来减轻铅对子代鼠的综合毒性。
研究报道,铅进入机体后通过与GSH、GSHPx、SOD等酶分子中-SH 及其活性中心金属离子作用,使这些抗氧化酶的活力下降[19]。与既往研究相同,本研究结果显示铅中毒子代鼠肝脏内抗氧化酶GSH、GSH-Px、SOD的活性降低,NO的水平升高(图3)。但经LGG 干预铅暴露母鼠后,铅中毒子代鼠肝脏抗氧化酶的活性恢复甚至有所提高,同时NO 活性降低,提示LGG 对铅致子代鼠肝脏的氧化损伤有抑制作用,从而保护子代鼠肝脏的健康。MAJLESI等[25]将L.plantarum CNR273和B.coagulans 用于汞中毒小鼠模型,也得到相同结果,即小鼠血液及肝、肾等靶器官的汞蓄积量减少,且汞导致的氧化应激损伤减轻。此外,经口摄入是铅主要的暴露途径,胃肠道是铅进入机体的第一道防线[1]。本研究病理结果显示,母鼠铅暴露致铅中毒子代鼠的小肠出现绒毛空泡消失、小肠腺萎缩等病理损伤(图4)。有研究指出,经消化道暴露铅会使肠屏障受到破坏,同时血脑屏障也会被损伤,进而引发神经性相关疾病[26]。大脑是铅的重要的靶器官,血铅水平与铅在脑的蓄积量紧密相关,而铅在脑的蓄积量决定了脑损伤的严重程度[27]。本研究发现,母鼠铅暴露致铅中毒子代鼠大脑发生以神经元萎缩、死亡为主的病理变化。经LGG 干预铅暴露母鼠后,铅中毒子代鼠小肠和大脑皮层的病理损伤得到有效的改善,表明LGG 干预母鼠能保护子代鼠小肠和大脑正常的生理结构免受铅的破坏。
综上,孕期及哺乳期母鼠铅暴露后可引起子代鼠铅中毒,使用LGG 干预铅暴露母鼠可减少铅在子代小鼠血液、骨骼、脑及肾脏中的蓄积,同时增强肝脏的抗氧化酶活力,并改善铅致小肠及脑的病理损伤,本研究为防治孕期及哺乳期铅暴露引起的子代铅中毒提供了一个新思路。LGG 防治母鼠暴露铅致子代鼠铅中毒的机制需进一步研究。