黄烈城 陈红燕 庞凤舜 秦有
1广州中医药大学第二临床医学院(广州510000);2广东省中医院芳村医院外科(广州510000)
术后疲劳是指手术后出现的以乏力、失眠、注意力不集中、抑郁、焦虑等症状为主要表现的一组症候群,是术后常见并发症,也称为术后疲劳综合征,严重影响着患者术后康复和长远的生存质量。目前对术后疲劳的发生机制尚未有完全统一的认识,一般认为与手术后炎症应激、营养障碍、免疫功能低下、神经递质含量变化、机体氧化应激状态、心理状态等相关[1-6],对于反映术后疲劳大鼠整体状态的具体代谢途径未作进一步研究。代谢组学作为一种系统的生物学方法可通过测定代谢调控的小分子代谢变化从而描述机体的整体状态,本文采用代谢组学方法研究中段小肠切除大鼠模型发生术后疲劳的机制,可以补充现有研究中对术后疲劳具体代谢途径的空白,更加全面地认识术后疲劳,为进一步促进术后疲劳恢复的药物和临床实验提供实验室基础,现报告如下。
1.1 实验仪器和试剂超高效液相色谱(UPLC)系统(SCIEX,UK),高分辨率串联质谱仪Triple TOF 5600 plus(SCIEX,UK),高速离心机,动物解剖台,甲醇,甲酸,乙酸铵等。
1.2 大鼠模型构造和血浆样品采集体质量200~240 g 健康SPF 级SD 雄性大鼠20 只,随机分为模型组和正常组各10 只,广东省中医院中心实验室提供的大鼠标准伺料,大鼠自由饮水摄食,动物房内温度20~24 ℃,相对湿度50%~60%,光线由实验室管理员控制明暗各12 h。
模型组采用中段小肠切除方法构造术后疲劳模型[7],正常组仅予等量水合氯醛麻醉,具体造模方法如下:大鼠禁食12 h 后称重,10%水合氯醛麻醉后背位固定(0.35 mL/100 g 体质量腹腔注射),备皮消毒铺巾,取腹白线上长约1.5 cm 切口入腹,顺系膜将肠管轻提出体外,从空肠起始附着点约10 cm 处开始标记70%中段小肠,丝线结扎肠系膜动脉截断血供后切除,用6-0 可吸收线均匀间断缝合肠管行端端吻合。确认吻合口血运情况良好,无梗阻及肠瘘情况,顺肠系膜方向将肠管送回腹腔,术毕关腹。
术后第1 天大鼠恢复进食及饮水,术后第8 天行腹主动脉采血。麻醉后沿腹白线开腹,暴露腹主动脉,一次性采血针插入动脉下段,连接含30 μL 10% EDTA-二钠的真空采血管采集血液,混匀,4 ℃条件下3 000 r/min 离心10 min,取上层血浆样品。最终采集的血浆样品,模型组n=7,正常组n=10,保存于-80 ℃冰箱中备用。
1.3 血浆样品预处理及LC-MS分析血浆样品于冰上解冻,用120 μL 预冷的50%甲醇提取20 μL样品,涡旋1 分钟,并在室温下孵育10 min;然后将萃取混合物在-20℃下储存过夜,4 000 r/min 离心20 min,将上清液转移至新的96 孔板中进行LC-MS 分析。此外,还通过组合10 μL 每种提取混合物来制备样品QC 样品用以判断仪器状态。
液相色谱条件:使用ACQUITY UPLC BEH 酰胺柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,Waters,UK)进行反相分离。柱温箱保持在35 ℃,流速为0.4 mL/min,流动相由溶剂A(25 mmol/L 乙酸铵+ 25 mmol/L NH4H2O)和溶剂B(IPA∶ACN=9∶1 + 0.1%甲酸)组成。梯度洗脱条件如下:0~0.5 min,线性变化至95%B;0.5~9.5 min,线性变化至95%~65%B;9.5~10.5 min,线性变化至65%~40%B;10.5~12 min,线性变化至40%B;12~12.2 min,线性变化至40%~95%B;12.2~15 min,线性变化至95%B;进样体积为4 μL。
质谱条件:Q-TOF 在正离子和负离子模式下操作,幕帘气体设定为30 PSI,离子源气体设定为60 PSI,界面加热器温度设定为650 ℃。对于正离子模式,离子喷涂电压浮动设定为5 000 V,对于负离子模式,离子的Ionspray 电压分别设置为-4 500 V。质谱数据以IDA 模式获得,TOF 质量范围为60~1 200 Da,总循环时间固定为0.56 s,动态排除设定为4 s,采集期间每20个样品校准质量准确度。
1.4 统计学方法LC-MS 原始数据文件转换为mzXML 格式,利用XCMS 软件做峰提取质控,进行峰提取。对提取到的物质利用CAMERA 进行加和离子注释,然后利用metaX 软件进行一级鉴定,分别使用质谱一级信息进行鉴定和质谱二级信息与in-house 标准品数据库进行匹配。候选鉴定物质分别利用HMDB、KEGG等数据库进行代谢物注释,解释代谢物的物理化学性质、生物功能。使用PCA、PLS-DA等方法筛选出重要差异性代谢产物,进行相关代谢途径分析。
2.1 大鼠血浆代谢谱分析采用正负离子切换模式采集大鼠血浆样品代谢谱信息,LC-MS 数据使用XCMS 软件进行峰提取,获得代谢物离子峰的质荷比、保留时间和离子面积等信息,共识别出正离子模式下6 828个离子信息,所得数据经预处理进入下一步分析,图1 为模型组(A)、正常组(C)大鼠血浆样品离子色谱图,图2 为大鼠血浆样品的典型总离子流色谱图(TIC)。
图1 正常组(A)、模型组(C)离子色谱图Fig.1 A model group and a normal group ion chromotogram
2.2 差异代谢物统计采用单变量分析差异倍数(fold-change)和T 统计检验得到的p-value 值,结合多变量统计分析PLS-DA 得到的VIP 值(variable important for the projection),来筛选差异表达的代谢物。差异离子同时满足条件:(1)ratio ≥2 或者ratio ≤1/2;(2)P value ≤0.05:(3)VIP ≥1。最终得到5 680个差异离子,术后疲劳大鼠较正常大鼠上调的差异离子数目322个,下调的差异离子数目580个。
图2 总离子流色谱图(TIC)Fig.2 Total ion chromotogram
2.3 多变量统计PCA、PLS-DA 分析主成分分析(principal component analysis,PCA)是一种降维方法,能将多个变量形成一组新的综合变量,再从中选取几个(通常是2~3个),从而尽可能多地反映原有变量信息。PCA 主要用于观察模型中组间分离趋势,以及是否出现异常点,同时从原始数据上反映组间和组内的变异度。对于检测到的物质和鉴定到的代谢物进行PCA 分析,PCA 得分图主要表示数据点的分布趋势,图中的每个点代表一个样本,所有样本之间的异同体现于得分图中样品的分离趋势或聚集度。模型组术后疲劳大鼠(A表示)与正常组大鼠(C 表示)在PCA 得分图上呈现分离趋势,说明术后疲劳大鼠与正常组代谢物存在差异(图3)。PCA 散点负载图反映导致样本区别的变量,其中变量离原点的空间距离越远,且与得分图样本分离轴趋势一致,则代表变量对模型的影响越大。图4 为模型组术后疲劳大鼠与正常大鼠的PCA 散点负载图。
图3 术后疲劳模型大鼠与正常大鼠PCA 得分图Fig.3 The rat of model group and a normal group scord were obtain Principal Component Analysis
PLS-DA 与主成分分析方法不同,它运用偏最小二乘回归方法建立关系模型实现代谢物表达量和样品类别之间的预测,最大程度地反映分类组别之间的差异,同时通过计算VIP 值(变量投影重要度)来衡量各代谢物表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力,从而辅助代谢标志物的筛选(一般以VIP≥1.0 为筛选条件)。本研究所建立模型参数R2=0.992(表示模型解释能力),参数Q2=0.879(表示模型预测能力),说明模型可靠。如图5 所示:得分图上两组大鼠呈明显分离趋势,表明血浆代谢谱存在明显差异,根据VIP值,并结合PLS-DA 散点负载图(图6)筛选出差异代谢物。
2.4 差异性代谢通路对定量的代谢物和差异的代谢物进行一二级鉴定结果注释,并对差异的物质一级分子量匹配到的KEGG 编号进行简单的差异通路分析。结果显示术后疲劳模型大鼠与正常大鼠相比在色氨酸代谢,戊糖和葡萄糖醛酸相互转化,精氨酸和脯氨酸代谢,细胞色素P450 对外源化合物代谢的影响,卟啉和叶绿素、叶酸合成、维生素B6、亚油酸代谢等代谢通路存在明显差异(P<0.05,表1)。
图4 术后疲劳模型大鼠与正常大鼠PCA 散点负载图Fig.4 The rat of model group and a normal group PCA scord Scatter load diagram
图5 术后疲劳大鼠与正常大鼠PLS-DA 得分图Fig.5 The rat of model group and a normal group scord were obtain Partial least squares discriminant analysis
图6 术后疲劳大鼠与正常大鼠PLS-DA 散点负载图Fig.6 The rat of model group and a normal group PLS-DA Scatter load diagram
代谢组学概念首先由NICHOLSON等[8]提出,其核心在于测定机体不同状态下参与代谢调控的小分子代谢变化,从而描述生物体对内外各种刺激做出的应答规律,揭示整体生命的动态过程和调控规律。作为一种系统的生物学研究方法,在疾病诊断、药理毒理、新药安全性评价、中药现代化机理等研究领域得到广泛运用。
本次实验中,术后疲劳大鼠与正常大鼠代谢途径存在明显差异,色氨酸是一种必需氨基酸,与人体内5-HT(5-羟色胺)的代谢密切相关。脑内5-HT 可能是中枢疲劳的调节物质,其增多可导致中枢疲劳;同时脑内5-HT 水平的升高与长时间运动性疲劳相关,在对运动性中枢疲劳的研究中使用5-HT 激动剂,结果显示服用激动剂的试验组平均力竭时间较对照组短,表明5-HT 对中枢疲劳具有促进作用。血浆中的5-HT 不能通过血脑屏障,因此必须在脑内合成,需要游离色氨酸转运至脑内,游离色氨酸的增加促进5-HT的生成,进而引起运动疲劳[9-10]。精氨酸是一种α-氨基酸,通过生物酶催化分解生成人体内源性一氧化氮(NO),NO 具有舒张血管、改善血液循环等生物学功能,研究[11]显示L-精氨酸体内代谢增加NO 水平,通过降低乳酸积累而产生抗疲劳效果。糖类物质作为最基本的供能物质,戊糖和葡萄糖醛酸相互转化过程形成的各种中间产物,以及能量供应方面的障碍也可能引起疲劳。
表1 术后疲劳大鼠与正常大鼠差异性代谢通路Tab.7 The rat of model group and a normal group differential metabolic pathways
综上,中段小肠切除大鼠发生术后疲劳的机制可能与色氨酸、精氨酸、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化等代谢途径变化引起的脑内5-HT 合成增多、血液循环功能减弱、能量供给障碍相关。本次实验使用代谢组学方法探讨中段小肠切除模型大鼠发生术后疲劳机制,补充了现有研究中对术后疲劳具体代谢途径的空白,对使用该模型进行更多的药物及临床研究具有理论和实用意义。由于目前非靶向代谢物的鉴定基于一级分子量误差,物质的鉴定仍需标准品来做靶向代谢物的验证,各代谢物的定性及定量仍需进一步实验研究,而各种药物及促进术后疲劳康复的干预措施如何通过影响代谢途径取得治疗效果是进一步研究的方向。