特立帕肽通过mTORC2 通路调控细胞骨架和黏附斑的观察研究

陈柏龄 吕中 艾克热木江·木合热木 白晓春 邹学农陈志鹏 林玮 袁伟权

1中山大学附属第一医院脊柱外科（广州510080）；2广东省骨科学重点实验室（广州510080）；3南方医科大学附属第三医院骨科（广州510050）；4南方医科大学基础医学院细胞生物学系器官衰竭研究国家重点实验室（广州510050）

在临床骨科诊疗中，常需要对患者进行骨植入物手术，植入物能否在主体骨中长期稳定地固定直接影响着患者的手术效果和术后康复。然而据统计，全球范围内人工关节置换术后长期松动率高达70%以上［1］。在骨折内钢板植入内固定的患者中，植入物松动失效的发生率同样居高不下，因此，近几十年来，有关促进植入物骨整合的研究一直是热点。

良好的植入物骨整合是指主体骨与植入物表面之间形成结构性功能联结，两者间的结构性功能联结紧密而无纤维组织形成。特立帕肽［PTH-（1-34）］做为被人工合成用于临床治疗的甲状旁腺激素，也是FDA 唯一批准的用于促进骨形成的药物，目前主要用于骨质疏松的研究［2-3］。但新近有临床病例报道和少量动物实验提示，PTH（1-34）还可能促进植入物的骨整合。ZATI等［4］报道1例77岁骨质疏松症患者全髋关节置换术后发生无菌性松动，在PTH（1-34）（20 μg/d）治疗8个月后，结果显示植入物周围皮质骨的厚度显著增加。JIANG等［5］对20个月龄的大鼠行植入手术后，每日注射30 μg/kg的PTH（1-34），持续5 周，发现可以促进新骨和植入物骨整。ALMAGRO等［6］制作骨质疏松兔模型，在胫骨干骺端近端种植钛棒，间歇运用PTH（1-34）12 周，发现可以增强钛棒周围的骨反应，并且显著增加骨密度。提示特立帕肽可以促进骨整合和骨-种植体界面的强度。可见，在将来临床中，PTH（1-34）有望成为用于促进植入物骨整合的一种很有前景的药物。不过，上述临床病例报道数较少，且仅通过X 线片来评估植入物骨整合程度。少量的动物实验中一般也只检测骨组织计量和生物力学指标，故PTH（1-34）促进植入物骨整合的作用尚需更多高质量的研究予以证实，其具体的作用机制也亟待探讨和阐明。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种存在于哺乳动物胞浆的一种非典型丝氨酸/苏氨酸激酶，是细胞发挥功能的重要调节蛋白，于其伴侣蛋白成份以及底物对雷帕霉素的敏感性和特异性，mTOR 可分为两种不同的蛋白复合物——mTORC1和mTORC2，近年来，mTORC2 在调控细胞迁移、黏附和细胞骨架重组的关键作用也得到证实［7-9］。在小鼠的受精卵中，mTORC2/Akt 在受精卵早期发育中参与肌动蛋白的重组［10］。SEN等［11］研究发现予以物理刺激干预间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）后，其纤维状肌动蛋白（F-actin）及黏附斑蛋白（vinculin）的表达升高，且与mTORC2 通路有关，当前有关mTORC2 调控细胞迁移及黏附的研究主要集中在肿瘤细胞和免疫细胞，而mTORC2 是否参与调控骨髓间充质干细胞（BMSCs）和成骨细胞的迁移及黏附尚不清楚。

目前，PTH（1-34）能否促进BMSCs的迁移、黏附作用的研究以及mTORC2 信号通路在其中的调控机制尚未见文献报道，因此，本研究探究特立帕肽对细胞骨架与黏附斑的影响，以及mTORC2 信号在其中介导的作用，探索植入物骨整合的分子机制，对防治植入物松动及失败，具有现实意义。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器与试剂

1.1.1 主要实验仪器垂直板蛋白电泳仪、电转仪（Bio-Rad，USA），光学倒置显微镜（Olympus，IX70，Japan），BeckMan-22R 高速低温离心机（Beck-Man，USA）

1.1.2 主要试剂F12 培养基（Gibco，China），胰酶（Gibco，USA），青、链霉素双抗（Gibco，USA），βactin 抗体（Cell Signaling Technology，CST，USA）Vinculin抗体（Cell Signaling Technology，CST，USA），特立帕肽（HEHOP-1601 中国苏州赛业生物科技有限公司）。

1.2 大鼠BMSCs的分离培养笔者从4～6 周龄的Sprague-Dawley（SD）大鼠中提取骨髓间充质干细胞。实验大鼠购于中山大学附属第一医院动物实验中心，饲养于无特定病原体（specific pathogen free，SPF）实验室，本研究经中山大学动物保护委员会批准（中山大学动物保护委员会批准）：［2014］52），并按照《实验室动物使用指南》执行。BMSCs 提取方法与鉴定同前［12］。取大鼠股骨和胫骨，无菌剥离软组织。取BMSCs，用5 mL 注射器冲洗骨髓腔。细胞在1 000g离心5 min，悬浮于添加10%胎牛血清的DMEM 中。细胞保持在37 ℃5%的二氧化碳的环境下。细胞孵育3 d 后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗一次贴壁层。每2 天更换一次培养基。细胞在80%～90%的融合后进行再培养。采用第三代BMSCs进行实验。

1.3 划痕实验BMSCs 以5×105个细胞的浓度种在6 孔板中。当细胞生长到90%汇合时，更换培养基，血清饥饿24 h。用无菌200 μL 枪头划开细胞层。用PBS 洗涤细胞两次，去除分离的细胞。随后分别用特立帕肽、雷帕霉素、PP242处理细胞。在0、24 h用显微镜观察细胞（Leica，DMI3000 B，德国）。

1.4 Transwell 迁移实验细胞迁移实验采用24孔双室transwell 系统（孔径8 mm，直径6.5 mm）（Corning，NY，USA）。上层加入无血清培养基并放入37 ℃孵育1 h，下层加入特立帕肽以及两种抑制剂，BMSCs 血清饥饿12 h，以1×105个细胞的密度/毫升（100 μL）加入到上层。然后将小室放置在培养箱中24 h，从下腔收集迁移的细胞，用结晶紫染色（Beyotime，Haimen，China）。选择5个随机显微镜视野（Leica，DMI3000 B，Germany）统计迁移的细胞。

1.5 黏附实验用10 μg/mL的FN（BIOYK，USA）预铺96 孔板，70 μL/孔，4 ℃后，PBS 洗3 遍，再用1%BSA 于37 ℃封闭1 h，PBS 洗3 遍。待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用无血清培养基悬浮细胞，用血球计数板计数，调整浓度为5 × 105/mL分别接种于预铺FN的96 孔板中，每孔5 000个细胞，每组设3个复孔。37 ℃孵育2 h 后，PBS 洗去未黏附的细胞。按照每孔加入100 μL 甲醇，固定15 min 每孔加入100 μL 吉姆萨染液，染色15 min，PBS 洗去染液倒置显微镜下随机取5个随机视野计数黏附细胞数量病拍照，统计结果。

1.6 免疫荧光不同处理组的细胞加入甲醛处理15 min，使用PBS 冲洗3 遍，洗去甲醛固定液后用1%的TritonX-100处理5 min。使用PBS 洗去Triton-X100 后，5%BSA 室温封闭30 min。PBS 配制一抗β-actin 抗体（Cell Signaling Technology，CST，USA）Vinculin抗体（Cell Signaling Technology，CST，USA），4 ℃过夜，PBS 洗3次，每次洗5 min。二抗孵育30～40 min。PBS 洗3次，每次洗5 min。滴加DAPI避光孵育5 min 对标本进行染核，用PBS 洗去多余的DAPI，用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.7 统计学方法采用SPSS 19.0 版软件进行处理。数据采用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较用多组独立样本t检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 特立帕肽能促进BMSCs的迁移和黏附能力通过划痕实验和Transwell 实验检测特立帕肽是否能促进BMSCs的迁移。对照组的愈合率为（0.21±0.067），特立帕肽浓度为10、20、50 nmol/L时各组细胞的愈合率分别为（0.75±0.025）、（0.80±0.037）、（0.78±0.035），差异有统计学意义（P＜0.05），迁移的细胞数分别为（45.33±7.02）、（38.67±4.04）、（41.67±5.13），差异有统计学意义（P＜0.05）。不同浓度的特立帕肽处理组的细胞愈合率和迁移的细胞数目与对照组比较差异有统计学意义。

通过黏附实验比较特立帕肽是否能促进BMSCs的黏附能力。对照组黏附的细胞数为（32.8±7.09），在10、20、50 nmol/L 浓度时3 组黏附的细胞数分别为（82.6±5.86）、（82.8±8.32）、（106.6±13.94），与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。证明特立帕肽能促进BMSCs的迁移黏附能力。见图1、表1。

2.2 mTORC2 信号通路参与BMSCs 特立帕肽依赖的迁移和黏附通过加入mTORC1 通路的抑制剂雷帕霉素和mTORC1/2 通路的抑制剂PP242，来验证mTORC2 信号通路是否参与特立帕肽依赖的迁移和黏附。与对照组相比，特立帕肽组愈合率为（0.82±0.035 24），迁移的细胞为（54.67±6.03）促进了细胞的迁移，差异有统计学意义（P＜0.05），而PP242 组愈合率为（0.038 6±0.013 2），迁移的细胞为（3±2）可以抑制特立帕肽的促进作用，并且加入特立帕肽后亦不能恢复细胞的迁移能力愈合率（0.044±0.022）迁移的细胞为（4.67±2.08），差异有统计学意义（P＜0.05），且PP242 组和PP242加特立帕肽组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。而加入mTORC1 通路抑制剂的雷帕霉素组愈合率（0.33±0.025），迁移的细胞为（25.33±4.51），与对照组比较差异无统计学意义。黏附实验中，PP242组黏附的细胞（9.30±2.44），加入特立帕肽后黏附的细胞为（12.35±3.64），之间差异没有统计学意义（P＞0.05）；单独加入特立帕肽组黏附的细胞为（89.6±7.86），与对照组（36.8±7.08）对比差异有统计学意义（P＜0.05）。而加入雷帕霉素组黏附的细胞为（32.5±4.95），与对照组对比差异无统计学意义。以上结果表明，特立帕肽更可能通过mTORC2 通路发挥其促进细胞迁移及黏附的功能。见图2、表2。

2.3 特立帕肽通过mTORC2 信号通路调控BMSCs 骨架和黏附斑在特立帕肽的作用下，BMSCs的中间丝和微丝结构清晰，细胞呈现得更大且呈多边形，黏着斑蛋白的表达增加（图3B 红点为黏着斑蛋白，由绿色箭头所示），反映出细胞更强的迁移和黏附能力。而在PP242的作用下，胞体变小，且呈现圆形或椭圆形中间丝和微丝结构紊乱，骨架纤维较小，结构不甚清晰，黏着斑蛋白的表达减少，加入特立帕肽后亦不能恢复其形态。与对照组相比，雷帕霉素对细胞骨架的影响不大，且加入特立帕肽后对细胞的骨架纤维和结构有一定的恢复，对黏着斑的影响不大。进一步说明特立帕肽能通过mTORC2 通路影响细胞骨架的变化从而促进细胞的迁移和黏附。见图3。

3 讨论

特立帕肽能促进细胞的迁移和黏附。骨向种植体表面的有效向内生长是骨整合的重要组成部分，而骨髓间充质干细胞和成骨细胞向表面的迁移黏附和分化是促进骨愈合的关键［5，13-15］。这两种过程都是成骨分化和骨矿化所必需的，因此，成功的骨整合取决于迁移和黏附的生物过程。有研究PTH 可以显着增强间充质干细胞（MSC）向腰椎区域的迁移，其中MSCs 分化为骨形成细胞［16］。而黏附能力也是影响细胞-材料相互作用的强弱的一个因素，黏附因子如vinculin的表达与细胞黏附能力有关，MSC 对底物特性敏感，其黏附能力决定了与植入物接触后细胞的增殖和分化能力［17］。本研究通过划痕实验、迁移实验、黏附实验，发现PTH（1-34）不仅可以促进BMSCs的迁移，还可以促进BMSCs的黏附能力。

图1 不同浓度的特立帕肽对BMSCs 愈合率（A）、迁移（B）和黏附能力（C）的影响Fig.1 Effect of different concentrations of teriparatide on healing rate（A），migration（B）and adhesion capacity（C）of BMSCs

表1 不同浓度的特立帕肽对BMSCs 愈合率、迁移和黏附的量化数据Tab.1 Quantitative data of different concentrations of teriparatide on the healing rate，migration and adhesion of BMSCs ±s

表1 不同浓度的特立帕肽对BMSCs 愈合率、迁移和黏附的量化数据Tab.1 Quantitative data of different concentrations of teriparatide on the healing rate，migration and adhesion of BMSCs ±s

注：与对照组比较，*P＜0.05

Wound closure area Transwell cell counting Adhesion cell counting Control 0.21±0.07 18.00±4.58 32.8±7.09 1 nmol/L 0.33±0.046 28.00±4.58 46.00±6.08 10 nmol/L 0.75±0.025*45.33±7.02*82.6±5.86*20 nmol/L 0.80±0.037*38.67±4.04*82.8±8.32*50 nmol/L 0.78±0.035*41.67±5.13*106.6±13.9*

特立帕肽能通过mTORC2 通路调控细胞骨架和黏附斑从而影响细胞的迁移黏附。良好的骨整合依赖于BMSCs向植入物迁移及黏附。细胞骨架和黏着斑是细胞发挥迁移黏附作用的功能基础［13，18］。细胞迁移过程中形状和运动的改变都取决于细胞骨架和黏着斑的直接变化。细胞骨架还具有帮助细胞移动行走的功能，细胞骨架控制核的形态和刚度是骨桥蛋白诱导BMSCs 迁移所必需的［19］。细胞骨架的形成是以vinculin 为标志蛋白，有研究发现vinculin和actin 联合参与黏附斑介导的机械应力传导［20］。提示骨整合区域的细胞骨架调整和黏附斑的形成在植入物骨整合中发挥着作用。

本研究发现，应用mTORC1的抑制剂雷帕霉素，特立帕肽的促进作用受影响不大，而应用mTORC1/2 抑制剂PP242，则PTH（1-34）的促进迁移黏附的作用明显被抑制。而笔者通过黏附斑和细胞骨架染色观察到在特立帕肽的作用下BMSCs

变得更大且呈多边形，呈现更多的骨架纤维和黏连，而pp242 可以显著抑制特立帕肽的作用，让细胞的肌动蛋白末端的骨架纤维较小，骨架结构紊乱。提示PTH（1-34）可以通过mTORC2 通路调控细胞骨架和黏附斑从而影响细胞的迁移黏附。

图2 特立帕肽和mTOR 通路抑制剂对BMSCs 愈合率（A）、迁移（B）和黏附（C）的影响Fig.2 Effect of teriparatide and mTOR pathway inhibitors on BMSCs wound closure rate

表2 特立帕肽和mTOR 通路抑制剂对BMSCs 愈合率、迁移和黏附量化数据Tab.2 Quantitative data on the wound closure rate，migration and adhesion of BMSCs by teriparatide and mTOR pathway inhibitors

综上所述，特立帕肽可影响骨髓间充质干细胞的细胞骨架和黏附斑的变化，并且可能由mTORC2 信号通路所介导，这也可能是特立帕肽促进骨髓间充质干细胞迁移和黏附，进而促进植入物骨整合的分子机制。

本研究首次提出mTORC2 信号通路可能参与调控PTH（1-34）促进BMSCs 在植入物表面的迁移和黏附，为骨组织工程领域中细胞与材料相互作用方面提供了新的观点，也将为临床防止植入物松动提供新的理论和实验依据。尽管本实验初步阐明mTORC2 信号通路可能参与调控特立帕肽促进BMSCs的迁移黏附，但是还具有一定的局限性。研究使用的是大鼠骨髓间充质干细胞，而不是基因上更适用的小鼠骨髓间充质细胞或更具临床转化性的人体细胞模型。并且缺乏相关的体内实验来探究PTH（1-34）对BMSCs的迁移和黏附的影响，还需要进一步深入研究。未来，笔者还将进一步探讨PTH（1-34）是否通过mTORC2 通路促进BMSCs的成骨分化功能的影响。拟采用成骨分化因子检测、骨植入物骨组织计量及生物力学检测电镜扫描，microCT等方法，并通过动物，从分子、细胞和动物水平来进一步研究mTORC2 信号通路在PTH（1-34）促进植入物骨整合中的作用及分子机制。