鸟苷酸二钠对Con A 致小鼠免疫性肝损伤保护作用的NF-κB 信号通路机制

韩少伟 李英霞 孙永琦 张玉镇 李盘欣 金少举，3

1商丘市第三人民医院（河南商丘476000）；2河南省南街村（集团）有限公司（河南临颍462600）；3漯河医学高等专科学校，河南省肿瘤发生与防治创新型科技团队（河南漯河462002）

肝脏是机体重要的物质代谢器官，是体内主要的生物转化场所，很多因素如药物、化学制剂、毒素、外伤、感染及免疫反应等都可能导致肝损伤（liver injury，LH），其受损将直接影响机体的代谢转化和有害物质的排泄等［1-2］。我国是肝病特别是病毒性肝炎的高发区，目前虽然有许多药物应用于临床用于治疗肝炎等肝损伤疾病，但其治疗效果及治愈率仍不理想，大多只能改善症状或延缓病情进展［3］。因此，寻找有效且安全的抗肝损伤药物是目前肝病防治的重要策略和当务之急。鸟苷酸二钠（disodium guanylate，GMP-Na2）是鸟苷酸的钠盐形式，是常用的食品添加剂和医药原料，具有抗氧化、促生长、调节免疫、协同抗肿瘤、调节营养代谢等生理或药理作用，而关于其是否有抗免疫性肝损伤的作用尚未见文献报道［4-6］。本研究采用刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）小鼠尾静脉注射法复制免疫性肝损伤动物模型，同时给予鸟苷酸二钠进行干预，观察其抗免疫性肝损伤作用，同时以NFκB 信号通路为研究靶点，探讨其肝保护作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物SPF 级ICR 小鼠，4～5 周龄，体质量18～22 g，雌雄各半，许可证号：SCXK（湘）2016-0002，湖南斯莱克景达实验动物有限公司。将小鼠饲养于动物房，10 只/笼，调整室内温度为22～25 ℃，湿度50%～60%，人工12 h/12 h 昼夜周期，自由饮食水，适应性饲养1 周后进行实验。

1.2 药品与试剂鸟苷酸二钠，纯度≥90%，由河南省南街村集团（有限）公司提供，批号：20160522；刀豆蛋白A（Type A Ⅳ型），100 mg/支，货号C8110-100 mg，北京索莱宝科技有限公司；联苯双酯滴丸（Bifendate pills），批号160710，北京协和药厂；谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒、还原性谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒等，由自南京建成生物工程研究所提供；兔抗IKKβ、IκBα、NF-κB、TNF-α及β-actin 抗体，购自美国Affinity Biosciences 公司；HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG 二抗、超敏ECL 化学发光液、RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、彩色预染蛋白Marker、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、PVDF 膜、蛋白上样缓冲液等，购自武汉博士德生物工程有限公司；Beyozol 总RNA 抽提试剂、BeyoRTTMⅢcDNA第一链合成试剂盒、Easy-LoadTMPCR Master Mix，由上海碧云天生物技术有限公司南通分公司提供；PCR 实验所需引物由南京金斯瑞生物科技有限公司设计合成。

1.3 主要仪器FA1004N 电子分析天平（上海精密仪器仪表有限公司）；752N 紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；H1850R 台式高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；IMS20 制冰机（河南天驰仪器设备有限公司）；Olympus BX51-P 显微镜（奥林巴斯（中国）有限公司）；Leica RM2235 切片机（德国徕卡）；GelDoc XR+凝胶成像系统、电泳槽、转印槽、C1000 Touch PCR 仪、通用型电泳电源（美国伯乐公司）。

1.4 实验动物分组、造模及给药将60 只ICR 小鼠随机分为6 组，分别为正常对照组、模型组（Con A）、阳性对照药组（联苯双酯200 mg/kg）及鸟苷酸二钠高、中、低（250、125、62.5 mg/kg）剂量组，每组10 只小鼠，雌雄各半。正常对照组、模型组小鼠灌胃生理盐水，其它各组灌胃相应剂量的药物，给药容量均为0.1 mL/10 g 体质量，每天1次，连续给药7 d。于末次给药后2 h，除正常对照组尾静脉注射生理盐水外，其余各组小鼠均尾静脉注射Con A（25 mg/kg）进行肝损伤造模，小鼠禁食不禁水。造模24 h 后，取小鼠血清检测ALT 及AST 活性，取肝左叶组织用于HE 染色病理检测，取肝右叶部分组织检测SOD、MDA、GSH-pX 及T-AOC 水平；取肝右叶部分组织采用RT-PCR 及Western Blot 法分析IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α mRNA和蛋白表达水平。

1.5 生化指标的检测造模后24 h，小鼠摘眼球取血，室温静置20 min，4 ℃2 500 r/min离心20 min，收集血清，按照说明书要求检测ALT 及AST 活性。取小鼠肝右叶组织约100 mg，于冰上充分匀浆，4 ℃3 000 r/min离心20 min，收集上清液，按照试剂盒说明书操作方法测定肝组织SOD、MDA、GSH-Px 及T-AOC 水平。

1.6 肝组织形态学观察小鼠取完血后，立即颈椎脱臼处死，取肝左叶用PBS 冲洗干净，置于4%多聚甲醛中固定24 h，用梯度乙醇进行脱水，然后依次进行石蜡包埋、切片及HE 染色，于显微镜下观察肝组织形态学变化。

1.7 RT-PCR 法检测肝组织IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α mRNA 表达水平取小鼠肝右叶组织约50 mg，用PBS 冲洗干净，迅速置入盛有液氮的研钵中充分研磨成粉末状，移入1.5 mL EP 管中，加入1 mL RNA 抽提试剂，按照试剂盒说明书抽提RNA，逆转录为cDNA 并进行PCR 实验。PCR 实验待测基因引物序列如下：IKKβ上游引物：5′-ACTCCAAAGTCCGGCAGAAG-3′，下游引物：5′-TCACGGGGTATGTGTGAACG-3′，产物288 bp；IκBα上游引物：5′-TCACCTACCAGGGCTACTCC-3′，下游引物：5′-CCTCTGTGAACTCTGACTCCG-3′，产物156 bp；NF-κB 上游引物：5′-CGTGCCCTCTGTCTAAGAGC-3′，下游引物：5′-GCCTCATAGTAGCCATCCCG-3′，产物186 bp；TNF-α上游引物：5′-AACTGTAAGCGGGGCAATCA-3′，下游引物：5′-TGAGGGTCTGGGCCATAGAA-3′，产物127 bp；β-actin上游引物：5′-GTTACAGGAAGTCCCTCACCC-3′，下游引物：5′-CAGACCTGGGCCATTCAGAAA-3′，产物194 bp。

1.8 Western Blot 法检测肝组织IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α蛋白表达水平取小鼠肝右叶组织约100 mg，用PBS 冲洗干净，置于匀浆器中，加入1 mL RIPA 蛋白裂解液，于冰上充分匀浆裂解，然后移入1.5 mL EP 管中，4 ℃12 000 r/min 离心20 min，吸取上清即为蛋白提取液，用BCA 法检测各样本蛋白浓度并调整一致，加入等体积Loading buffer（2×），于沸水中煮沸5 min 使蛋白变性，然后每样取15 μL 进行SDS-PAGE 凝胶电泳，按照Western Bolt 操作流程依次进行转膜、抗原封闭、孵育一抗、孵育二抗及加ECL 显色液显影，于凝胶成像仪下拍照成像，读取各样本条带灰度值，以β-actin 为参照分析待测目的蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件包进行统计处理。实验数据以（）表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计分析，两组间样本均数比较采用独立样本t检验，P＜0.05 表示组间差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 鸟苷酸二钠对Con A 致肝损伤小鼠血清ALT、AST 活性的影响与正常对照组比较，Con A 肝损伤模型组小鼠血清ALT、AST 活性明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，鸟苷酸二钠250、125 mg/kg 组小鼠血清ALT、AST 活性降低，鸟苷酸二钠62.5 mg/kg 组小鼠血清AST 活性降低（P＜0.05）。见表1。

表1 鸟苷酸二钠对Con A 致肝损伤小鼠血清ALT、AST 活性的影响Tab.1 Effects of GMP-Na2 on the activities of ALT and AST in mice with liver injury induced by Con A ±s

表1 鸟苷酸二钠对Con A 致肝损伤小鼠血清ALT、AST 活性的影响Tab.1 Effects of GMP-Na2 on the activities of ALT and AST in mice with liver injury induced by Con A ±s

注：与正常对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常对照组模型组联苯双酯鸟苷酸二钠剂量（mg/kg）——200 250 125 62.5 ALT（U/L）27.04±4.72 88.41±6.29**31.50±3.36##38.33±6.27*##53.82±5.62**##82.81±7.64**AST（U/L）35.24±4.12 81.09±4.15*40.62±6.19##45.69±5.96*#57.93±4.74**##69.35±5.03**##

2.2 鸟苷酸二钠对Con A 致肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA、GSH-Px 及T-AOC 水平的影响与正常对照组比较，Con A 肝损伤模型组小鼠肝组织SOD、GSH-Px 及T-AOC 水平下降，MDA 含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，鸟苷酸二钠250、125 mg/kg 组小鼠肝组织SOD、GSH-Px 及T-AOC 水平显著升高，MDA 含量下降（P＜0.05）。见表2。

表2 鸟苷酸二钠对Con A 致肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA、GSH-Px 及T-AOC 水平的影响Tab.2 Effects of GMP-Na2 on the levels of SOD，MDA，GSH-Px，T-AOC in liver tissue of mice with liver injury induced by Con A ±s

表2 鸟苷酸二钠对Con A 致肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA、GSH-Px 及T-AOC 水平的影响Tab.2 Effects of GMP-Na2 on the levels of SOD，MDA，GSH-Px，T-AOC in liver tissue of mice with liver injury induced by Con A ±s

注：与正常对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常对照组模型组联苯双酯鸟苷酸二钠剂量（mg/kg）——200 250 125 62.5 SOD（U/mgprot）60.37±4.10 33.68±3.25**56.52±5.17##47.87±4.02**##40.97±4.18**#36.90±3.96**MDA（nmol/mgprot）1.36±0.35 3.72±0.43**1.62±0.25##1.81±0.19*##2.49±0.23**##3.09±0.26**#GSH-Px（U/mgprot）155.94±9.13 105.82±11.96**148.51±7.43##147.10±6.89##135.39±5.62**##118.76±7.69**T-AOC（U/mgprot）4.66±0.42 1.91±0.31**4.27±0.39##4.06±0.48##3.54±0.41**##2.34±0.35**

2.3 鸟苷酸二钠对Con A 致肝损伤小鼠肝组织形态学的影响正常对照组小鼠肝组织镜下可见肝小叶结构清晰，肝索排列整齐，肝细胞结构完整，未见变性或坏死；模型组小鼠肝组织镜下可见肝组织多量大面积变性、坏死或干酪样变，肝索排列紊乱，肝细胞结构模糊，有大量炎性细胞浸润；鸟苷酸二钠250 mg/kg 组小鼠肝组织可见少量炎性细胞浸润，肝索排列较为整齐，细胞间隙尚可，有少量肝细胞水肿或点状坏死，但较模型组明显改善。见图1。

图1 鸟苷酸二钠对Con-A 致肝损伤小鼠肝组织形态学的影响（HE 染色，200×）Fig.1 Effects of GMP-Na2 on pathology in liver tissue of mice with liver injury induced by Con-A（HE staining，200×）

2.4 鸟苷酸二钠对Con A 致肝损伤小鼠肝组织IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α mRNA 表达水平的影响与正常对照组比较，Con A 肝损伤模型组小鼠肝组织IKKβ、NF-κB和TNF-α mRNA 表达水平上调，IκBα mRNA 表达水平下调；与模型组比较，鸟苷酸二钠250 mg/kg 组小鼠肝组织IKKβ、NF-κB和TNF-α mRNA 表达水平下调，IκBα mRNA 表达水平上调。见图2、表3。

图2 鸟苷酸二钠对Con-A 致肝损伤小鼠肝组织IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α mRNA 表达水平的影响Fig.2 Effects of GMP-Na2 on the mRNA expression levels of IKKβ,IκBα,NF-κB and TNF-α in liver tissue of mice with liver injury induced by Con-A

2.5 鸟苷酸二钠对Con A 致肝损伤小鼠肝组织IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α蛋白表达水平的影响与正常对照组比较，Con A 肝损伤模型组小鼠肝组织IKKβ、NF-κB和TNF-α蛋白表达水平升高，IκBα mRNA 表达水平下降；与模型组比较，鸟苷酸二钠250 mg/kg 组小鼠肝组织IKKβ、NF-κB和TNF-α mRNA 表达水平降低，IκBα mRNA 表达水平增多。见图3、表4。

图3 鸟苷酸二钠对Con-A 致肝损伤小鼠肝组织IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α蛋白表达水平的影响Fig.3 Effects of GMP-Na2 on the protein expression levels of IKKβ,IκBα,NF-κB and TNF-α in liver tissue of mice with liver injury induced by Con-A

表3 鸟苷酸二钠对Con A 致肝损伤小鼠肝组织IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α mRNA 表达水平的影响Tab.3 Effects of GMP-Na2 on the mRNA expression levels of IKKβ，IκBα，NF-κB and TNF-α in liver tissue of mice with liver injury induced by Con A ±s

表3 鸟苷酸二钠对Con A 致肝损伤小鼠肝组织IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α mRNA 表达水平的影响Tab.3 Effects of GMP-Na2 on the mRNA expression levels of IKKβ，IκBα，NF-κB and TNF-α in liver tissue of mice with liver injury induced by Con A ±s

注：与正常对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常对照组模型组鸟苷酸二钠剂量（mg/kg）--250 IKKβ/β-actin 0.201±0.027 0.595±0.024**0.228±0.020##IκBα/β-actin 0.642±0.043 0.208±0.031**0.349±0.050**##NF-κB/β-actin 0.121±0.023 0.672±0.040**0.451±0.046**##TNF-α/β-actin 0.174±0.029 0.792±0.046**0.397±0.042**##

表4 鸟苷酸二钠对Con A 致肝损伤小鼠肝组织IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α蛋白表达水平的影响Tab.4 Effects of GMP-Na2 on the protein expression levels of IKKβ，IκBα，NF-κB and TNF-α in liver tissue of mice with liver injury induced by Con A ±s

表4 鸟苷酸二钠对Con A 致肝损伤小鼠肝组织IKKβ、IκBα、NF-κB和TNF-α蛋白表达水平的影响Tab.4 Effects of GMP-Na2 on the protein expression levels of IKKβ，IκBα，NF-κB and TNF-α in liver tissue of mice with liver injury induced by Con A ±s

注：与正常对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常对照组模型组鸟苷酸二钠剂量（mg/kg）--250 IKKβ/β-actin 0.223±0.036 0.794±0.035**0.546±0.037**##IκBα/β-actin 0.693±0.043 0.310±0.044**0.518±0.051**##NF-κB/β-actin 0.204±0.032 0.652±0.047**0.457±0.037**##TNF-α/β-actin 0.151±0.013 0.863±0.033**0.508±0.026**##

3 讨论

Con A 是一种从刀豆中提取分离而得的植物凝集素，为四聚体球蛋白，影响机体免疫功能，激活T 淋巴细胞，可产生大量炎性细胞因子（包括IL-4、IL-6、TNF-α及IFN-γ等）、趋化因子等，破坏肝细胞完整性，导致肝损伤［7-9］。小鼠尾静脉注射Con A 复制的免疫性肝损伤动物模型，与人类病毒性肝炎及自身免疫性肝病发病过程相似，是筛选和研究肝损伤保护药的常用动物模型［10-11］。ALT、AST 是肝细胞内重要的转氨酶，参与肝代谢的转氨基作用。在生理状态下，转氨酶主要存在于肝细胞内参与物质代谢转化，当肝细胞出现损伤坏死等病理情况时，ALT、AST等转氨酶就会释放到血液中，导致血清转氨酶增多，故临床上常通过检测血清ALT、AST等转氨酶活性来判断肝功能和肝损伤的严重程度［12］。在本研究中，Con A 模型组小鼠血清ALT和AST 活性较正常对照组明显升高，表明Con A 致小鼠肝损伤模型复制成功。同时，提前给予鸟苷酸二钠250、125 mg/kg，可显著降低肝损伤小鼠血清ALT和AST 活性，并且鸟苷酸二钠250 mg/kg 可显著缓解Con A 致肝损伤小鼠肝组织病理学形态变化，提示鸟苷酸二钠对Con A 致小鼠肝损伤具有一定的保护作用。但关于鸟苷酸二钠的肝保护作用的机制尚不清楚，为此作者以氧化应激和NF-κB 信号通路为研究对象进行了初步探讨。

肝细胞在Con A 诱发的炎症因子等刺激下，发生氧化损伤，产生大量的氧自由基和脂质过氧化代谢产物，破坏肝细胞结构的完整性，引起肝细胞变性或坏死，导致肝损伤和肝脏功能下降［13］。SOD、GSH-Px 是体内重要的抗氧化酶，可帮助细胞清除氧自由基和过氧化代谢产物等，其活性大小可反映机体的抗氧化能力；T-AOC 是机体抗氧化能力的总和，亦是评价机体清除氧化代谢产物的重要指标之一；MDA 是脂质过氧化代谢产物，其含量增多必然会加重细胞损伤，导致细胞代谢功能障碍甚至坏死［14-15］。本研究发现，鸟苷酸二钠250、125 mg/kg 可显著增加Con A 致肝损伤小鼠肝组织SOD、GSH-Px 及T-AOC 水平，降低MDA 含量，提示鸟苷酸二钠可通过抑制氧化应激反应防治免疫性肝损伤。

炎症反应是肝损伤的主要表现，Con A 可促使炎症因子（TNF-α等）的生成和释放，TNF-α等因子可抑制IKKβ磷酸化，使IKKβ含量增多，但可促进IκBα发生磷酸化，使得p-IκBα水平增多，IκBα含量下降，促进NF-κB 从IκBα/NF-κB 复合体上游离出来，游离的NF-κB 可通过核膜进入细胞核内，与其相应的DNA 反应元件结合，促进炎症因子TNF-α、IL-1β及IFN-γ等的生成，这些生成的炎症因子又可反过来激活NF-κB 信号通路，反复促进炎症反应，进一步加重肝细胞损伤，在此信号通路中NF-κB 是关键因子［16-18］。本研究发现，鸟苷酸二钠250 mg/kg 可下调Con A 致肝损伤小鼠肝组织IKKβ、NF-κB和TNF-α mRNA和蛋白表达水平，上调IκBα mRNA和蛋白表达水平，提示鸟苷酸二钠抗Con A 致小鼠肝损伤与其抑制NF-κB 信号通路有关。

综上所述，鸟苷酸二钠对Con A 致小鼠肝损伤具有较好的防治作用，其作用机制与抗氧化应激和抑制NF-κB 信号通路有关。