BX-912对脂多糖诱导小鼠颅骨骨溶解症状的影响

高云兵 岑忠喜 黄建华 邓贵营 何基琛 曾高峰 宗少晖

1广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科（南宁530000）；2广西医科大学公共卫生学院（南宁530000）

在人体正常的生理条件下，成年人骨骼中的骨吸收和骨形成处于动态稳定状态，从而不断更新骨组织，不断保持骨组织的硬度与弹性。破骨细胞是人体中唯一的骨重吸收功能的细胞，对骨的重塑有重大意义。骨组织中破骨细胞的过度分化和活化，是造成骨质疏松症的重要原因之一［1］。骨质疏松症是一种年龄相关的疾病，其主要特征是以骨量减少、微结构破坏，骨骼脆性增加、易发生骨折，是老年人致残、致死的重要原因之一［2］。流行病学调查显示：截止到2010年，我国骨质疏松性骨折患者大约有233 万例，其中髋部的骨折大约有36 万例，椎体的骨折大约111 万例，其他骨质疏松性骨折大约86 万例，为此所支出的医疗费用高达94.5 亿美元［3］。

正因为目前临床上骨质疏松症的治疗存在治疗周期长、费用高昂、全身性副作用较大等许多缺陷，因此寻找有效的治疗骨质疏松症的药物是非常重要和急切的［4］。在前人的研究中，笔者知道磷酸肌醇依赖的蛋白激酶-1（PDK-1）具有促进骨肉瘤增殖分化的能力，继而导致骨肉瘤复发与转移［5］。目前国内外对PDK-1的研究主要集中在肿瘤、细胞自噬等方面［6-7］，在骨科领域尤其是骨质疏松症方面尚未有明确系统的报道。在本研究中笔者讨论了PDK-1在骨质疏松症中发挥的作用，首次创新性地报道了PDK-1 特异性抑制剂（BX-912）可以改善LPS 诱导的小鼠颅骨骨溶解症状。本实验数据显示，BX-912 可以抑制LPS 诱导的小鼠颅骨骨溶解，具有潜在治疗骨质疏松症的作用，为临床治疗骨质疏松症提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 一般材料6 周龄雄性C57BL/6 小鼠由广西医科大学动物实验中心提供，BX-912 购于Selleck公司，α-MEM 培养基购于Gibco 公司，胎牛血清购于Hyclone 公司，M-CSF和RANKL 购自R&D 公司，戊巴比妥钠、脂多糖、0.25%胰酶、CCK-8 试剂盒、TRAP 染色试剂盒购自Sigma 公司。

1.2 BMMs的获取及培养采用颈椎脱位法处死小鼠，75%酒精中浸泡5 min，分离胫骨和股骨。去除骨盆和股骨骨骼周围残留的组织，并在膝关节分离，将骨头浸入75%酒精中5 min，随后在PBS 中浸泡5 min，后将其放入DMEM 培养基中。小心剪去骨头的两端，用冲洗出骨髓腔内的细胞。收集细胞悬浮液到离心管并以1 000 r/min 离心5 min。去除上清液后，将细胞重悬于含有10%胎牛血清和M-CSF（25 μg/L）的α-MEM 培养基中并种植到T-75培养瓶中，并在温度为37 ℃，5%CO2的培养箱中培养细胞，每3 天更换1次含有M-CSF的培养液。在第5 天将BMMs 以6 × 103个细胞/孔的密度转移到96孔板中，进行下一步实验。

1.3 细胞增殖-毒性检测（CCK-8）通过CCK-8测定BMMs 细胞活性。将BMMs 以6 000/孔的密度接种在96 孔板上，在含有浓度为25 μg/L的M-CSF的完全培养液中培养24 h，每个浓度接种3个复孔。24 h后，将细胞用不同浓度的BX-912（0、0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L）处理0、1、2、3、4和5 d。每孔加入10 μL CCK-8 缓冲液，并将孔板温育2 h。借助于Microplate Reader795 测量450 nm 波长处的OD值，并进行数据统计分析。

1.4 破骨细胞诱导分化及TRAP 染色小鼠骨髓全细胞在含有浓度为25 μg/L的M-CSF的培养液中培养5 d 后，以8 000/孔的密度种植在96 孔板中，加入含有M-CSF的培养液在培养箱中培养24 h，随后更换为含有M-CSF（25 μg/L）和RNAKL（100 μg/L）的培养液，同时加入0 μmol/L和0.312 μmol/L 浓度的BX-912，每个浓度接种3个复孔。诱导分化5 d后，吸出培养液用PBS 清洗2次，用4%多聚甲醛固定30 min，吸出多聚甲醛，PBS 清洗2次，每孔加入100 μL TRAP 染液，37 ℃下避光孵育30 min。吸出染液，加入PBS 后再显微镜下拍照并计数破骨细胞数量。

1.5 LPS 诱导小鼠颅骨骨溶解模型将30 只6 周龄C57BL/6 雄性小鼠随机分为3 组，每组10 只，分别为：对照组（注射PBS）、LPS 组（5 mg/kg 体质量注射）、BX-912 治疗组（LPS 干预和5 mg/kg 体质量注射）。在轻度麻醉下，小鼠在颅骨的矢状线缝合处皮下注射。在注射LPS 前1 天注射PBS和BX-912（预防性治疗），随后在28 d 内每隔1 天注射。在实验结束后，处死小鼠，分离颅骨并用4%多聚甲醛固定用于micro-CT和组织学染色分析。组织学染色分析分析，首先将颅骨在4 ℃，10%EDTA（pH 7.4）条件下脱钙2 周，然后在石蜡中包埋。制作切片用于H&E 染色和TRAP 染色。

1.6 统计学方法所有实验数据均使用表示，采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，多样本均数进行单因素方差分析，LDS 检验进行2 组间比较，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8 检测细胞增活性在体内研究BX-912 对小鼠颅骨骨溶解的作用前，笔者首先需要确定BX-912的安全浓度范围。笔者设置了10个不同的BX-912 浓度（0、0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10和20 μmol/L）测定BX-912 在0、1、2、3、4和5 d 对细胞的毒性作用。在BX-912 浓度为0.625 μmol/L 及更高浓度时，OD值与对照组相比明显下降（P＜0.05），在浓度为0.312 μmol/L 及更低浓度时，BX-912 对细胞没有明显的毒性作用（表1）。

表1 CCK-8 实验测定BX-912的安全浓度范围Tab.1 CCK-8 experimental determination of the safe concentration range of BX-912 ±s

表1 CCK-8 实验测定BX-912的安全浓度范围Tab.1 CCK-8 experimental determination of the safe concentration range of BX-912 ±s

注：通过CCK-8 测定在BX-912 干预BMMs 在0、24、48、72、96和120 h的OD 值。与对照组相比，BX-912 组（0.625～20）μmol/L 中的OD值显著降低。BX-912 浓度在0.312 μmol/L 及以下时对BMMs 活性没有显著影响（*P＜0.05）

BX-912 浓度干预（μmol/L）0 0.078 0.156 0.312 0.625 1.25 2.5 5 10 20 0 h 1.12±0.032 1.13±0.023 1.11±0.030 1.13±0.021 1.11±0.026 1.13±0.026 1.12±0.034 1.10±0.039 1.11±0.025 1.11±0.033干预24 h 1.36±0.035 1.34±0.033 1.41±0.040 1.35±0.031 1.38±0.029 1.42±0.041 1.34±0.051 0.85±0.030*0.30±0.021*0.27±0.016*干预48 h 1.55±0.050 1.53±0.045 1.61±0.061 1.60±0.053 1.57±0.066 1.51±0.043 1.48±0.040 0.77±0.036*0.31±0.025*0.25±0.020*干预72 h 1.30±0.040 1.28±0.035 1.33±0.041 1.28±0.061 1.35±0.055 1.01±0.044*0.91±0.037*0.70±0.030*0.28±0.022*0.24±0.031*干预96 h 1.35±0.036 1.40±0.041 1.38±0.033 1.33±0.045 1.20±0.037 0.80±0.025*0.75±0.040*0.74±0.031*0.30±0.021*0.27±0.024*干预120 h 1.43±0.280 1.50±0.041 1.46±0.033 1.39±0.037 1.03±0.022*0.77±0.051*0.73±0.038*0.68±0.022*0.27±0.023*0.22±0.036*

2.2 BX-912 对破骨细胞分化的影响小鼠BMMs在含有M-CSF（25 μg/L）和RNAKL（100 μg/L）的培养液中，同时加入0 μmol/L和0.312 μmol/L 浓度的BX-912 干预。诱导分化5 d 后，TRAP 染液确定每组的破骨细胞生成数。结果显示：0.312 μmol/L 浓度的BX-912 对破骨细胞生成有明显的抑制作用（P＜0.001，图1）。

图1 BX-912 对破骨细胞生成的抑制作用Fig.1 Inhibition of BX-912 on osteoclastogenesis

2.3 BX-912 保护LPS 诱导的颅骨骨溶解在6 周龄的C57BL/6 小鼠颅盖的矢状缝局部皮下注射PBS、LPS、LPS+BX-912。28 d后，与PBS相比，micro-CT 分析显示LPS 组小鼠颅骨骨溶解严重，骨小梁分离度显著增加，骨体积分数、骨小梁数量明显降低，BX-912 治疗组可以明显提高骨体积分数、增加骨小梁数量，降低骨小梁分离度，骨小梁厚度无明显影响（P＜0.01，P＜0.001）表明BX-912 具有保护LPS诱导的颅骨骨溶解的作用（表2）。组织学H＆E染色结果显示，BX-912可以显着增加骨小梁厚度和骨小梁的数量（图3）。组织学TRAP 染色结果显示，BX-912 可显着抑制LPS 诱导的颅骨骨溶解模型中的破骨细胞生成，减少骨量损失（P＜0.001，图4）。

表2 BX-912 对小鼠颅骨骨溶解的保护作用Tab.2 Protective effect of BX-912 on osteotomy of mouse calvaria ±s

表2 BX-912 对小鼠颅骨骨溶解的保护作用Tab.2 Protective effect of BX-912 on osteotomy of mouse calvaria ±s

注：LPS 组小鼠颅骨骨溶解严重，骨体积分数和骨小梁数量明显降低，骨小梁分离度显著增加，BX-912 治疗组可以明显提高骨体积分数、增加骨小梁数量，降低骨小梁分离度（**P＜0.01，***P＜0.001）

组别PBS 组LPS 组LPS+BX-912骨体积分数65.3±3.14***35.6±4.60 56.8±2.41**骨小梁数量8.80±0.55***73.05±0.26 7.68±0.41***骨小梁分离度0.11±0.015***0.19±0.025 0.14±0.033***骨小梁厚度0.109±0.005 0.101±0.004 0.106±0.006

3 讨论

骨组织是人体的坚硬组织，具有储藏矿物质、运动、支持和保护身体等其他重要的功能。骨的重塑是有破骨细胞和成骨细胞共同调控的，当某些病理性因素导致破骨细胞的生成增多或（和）活性增强，就可能导致一些骨溶解疾病，例如骨质疏松症、骨关节炎、炎性无菌性松动等，因此抑制破骨细胞的生成和活性已经成为治疗骨质疏松重要的靶点。

图3 组织学H&E 染色Fig.3 Histological H&E staining

图4 组织学TRAP 染色Fig.4 Histological TRAP staining

破骨细胞是骨组织中唯一可以进行骨重吸收功能的细胞［8］。破骨细胞分化与成熟过程中需要M-CSF 与RANKL 这两个最重要的两个细胞因子。RANK/RANKL 信号通路是骨重建的经典信号通路，RANK 是RANKL的唯一的受体，属于Ⅰ型膜蛋白［9］。成骨细胞表达的RANKL 可以与OCPs的RANK 结合，从而激活下游信号分子。肿瘤坏死因子受体相关因子（TNF receptor-associatedfactor，TRAF）可以与RNAK 进行结合，其中TRAF6 与破骨细胞的生成有关。RANK 与TRAF6 结合可以促使NF-κB 激活，c-Fos 被入核的NF-κB 激活，活化的T 细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT-c1）与激活的c-Fos 进一步与结合并发挥作用，最终促进破骨细胞生［10］。在本实验中，破骨细胞受到LPS 刺激后可增强对小鼠颅骨的骨吸收，导致出现骨质疏松症。脂多糖（LPS）是革兰阴性菌细胞壁中的一种主要成分，作用于人体内的巨噬细胞等，从而产生白细胞介素1、6和肿瘤坏死因子α等细胞因子，促进破骨细胞分化［11］。调节破骨细胞前体细胞融合的基因有Connexin43、DCSTAMP、OC-STAMP等，它们调节破骨细胞前体细胞的迁移，细胞之间的交流，促进破骨细胞前体细胞相互融合［12］。曾立等［13］发现LPS 在促进破骨细胞生成过程中，能够显著促进Connexin43 蛋白表达量的增加，同时能够促进Connexin43 基因表达，并且呈明显的浓度依赖性。Connexin43 是细胞之间营养素、代谢产物、小分子等彼此交换的重要通道［14］，在破骨细胞的形成、发挥骨吸收功能、以及骨重建过程中发挥了重要的作用。LPS 通过促进Connexin43 表达，提升了破骨细胞前体细胞间小分子物质的交换，促进了破骨细胞的生成，使诱导生成的破骨细胞更多、体积更大，进而提升了破骨细胞的骨吸收功能。LPS 同时也是一种导致炎症性骨丢失的病原体［15］。临床上，细菌感染导致的骨不连、感染性关节炎的患者往往伴有骨吸收异常增强导致的骨丢失。

在本研究中，笔者明确了PDK1 特异性抑制剂（BX-912）在0.312 μmol/L 及以下浓度时对BMMs的活性没有明显抑制，同时在本实验中构建了LPS诱导小鼠颅骨骨溶解模型并与BX-912 治疗组进行对比，通过micro-CT 扫描、H&E 染色、TRAP 染色分析。在BX-912 治疗组，micro-CT 扫描重建及软件分析显示骨体积分数、骨小梁数目明显提高、骨小梁分离度降低，证明BX-912 在LPS 诱导颅骨骨溶解模型中具有抑制骨溶解的作用。组织切片H&E 染色发现BX-912 治疗后以改善LPS 引起的颅骨缺损症状，并显著增加骨小梁厚度和骨小梁的数量，组织切片TRAP 染色发现BX-912 可显著抑制LPS 诱导的颅骨骨溶解模型中的破骨细胞生成。笔者的数据表明BX-912 具有潜在预防和治疗与破骨细胞有关的骨质疏松症的作用，提示临床上治疗因感染导致的骨丢失时，抑制LPS 吸收是重要的关键措施。在笔者之前尚未有PDK-1 在骨质疏松症中的作用的相关报道，笔者相信这项研究是有意义并且有前景的。同时笔者的工作存在一些不足之处，没有对具体的生物学机制和成骨细胞的作用的进行深入的研究，接下来笔者将完善BX-912 抑制破骨细胞生成的具体生物学机制，同时将对成骨细胞的作用进行研究。