枳葛口服液含药血清对乙醇诱导L-02 肝细胞氧化损伤的抗氧化作用

黄素琼 侯英 王晓栋 李波 刘友平 魏嵋

1西南医科大学附属中医医院（四川泸州646000）；2西南医科大学附属医院（四川泸州646000）；3西南医科大学基础医学院（四川泸州646000）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）主要因长期大量饮酒引起，早期表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝癌等［1-3］。ALD 在我国目前已是继病毒性肝炎之后的第二大肝脏疾患，且目前西医药对ALD的逆转治疗效果不佳，这给个人、家庭及社会带来了严重负担［4-5］。近年来，本院著名全国名老中医孙同郊根据泸州地域特点，并结合大量的临床经验，得出了药食同源的专方——枳葛解酒方，目前已将该方制成浓缩口服液——“枳葛口服液”，在一定范围内使用，其疗效和口感均得到普遍好评，前期动物实验表明枳葛口服液能减轻乙醇诱导的肝功能损伤，降低血脂，减少血清中炎症因子，其发生作用机制可能与肝脏参与氧化应激的调控有关［6］。ALD的发病机制及其复杂，其中氧化应激在ALD的发生中起到了核心作用［7］。因此，往往通过检测肝细胞内抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活力能准确地反映肝脏抗氧化应激的水平，检测氧化应激指标丙二醛（malondialdehyde，MDA）、活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的活性反映肝脏氧化应激所导致的细胞膜损伤程度［8-9］。为了进一步确定在酒精性肝损伤过程中枳葛口服液是否参与氧化应激的调控，本研究采用乙醇对L-02 肝细胞进行诱导产生氧化应激反应，并同时加用枳葛口服液含药血清进行干预，观察枳葛口服液含药血清对乙醇诱导L-02 肝细胞氧化应激损伤模型中氧化应激指标MDA、ROS 及抗氧化酶SOD 活力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料清洁级雄性SD 大鼠40 只，体质量175～215 g，由西南医科大学实验动物中心提供，合格证号：SYXK（川）2013-065。枳葛口服液由西南医科大学附属中医医院制剂室提供，规格20 mL× 6 支/盒，处方组成有枳椇子、葛根、山楂等，有效期2年，批号20171026。人正常肝细胞株（L-02 肝细胞），由西南医科大学附属中医医院中心实验室提供。普通饲料由西南医科大学实验动物中心提供；SOD、MDA 及ROS 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；细胞增殖毒性检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK8）试剂购自碧云天生物技术有限公司，胎牛血清购自美国ZEALWAY 公司。本实验经过本院伦理委员会的审批。

1.2 方法

1.2.1 枳葛口服液含药血清的制备根据《动物与人体的每千克体质量剂量折算系数表》换算出每只大鼠所需药物剂量并参照吴健等［10］提出的具体给药剂量公式：给药剂量=在体试验的给药剂量×反应系统中被稀释的倍数，最终按大鼠用药剂量的10 倍灌胃，即枳葛口服液组［8.85 g 生药/（100 g 体质量·d）］，对照组（等体积的生理盐水），每日早、晚各灌胃1次，连续5 d。于最后一次给药1 h 后利用2%戊巴比妥钠（0.3 mL/100 g）麻醉全部大鼠于腹主动脉取血，将所得血液在室温下静置2 h，3 000 r/min 离心10 min，将组内血清混合，利用0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后置-80 ℃冰箱冻存备用。

1.2.2 L-02 肝细胞氧化损伤造模将细胞消化后对细胞进行计数使最终密度为2 × 1110个/mL 并接种于6 孔板中，实验分为8个组，即对照组和7个不同乙醇浓度组（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、5%），每组设6个复孔，分别干预L-02 肝细胞6、12、24 h，根据细胞活力及L-02 肝细胞中MDA和ROS 水平以确定乙醇造模的最佳浓度及作用时间。

1.2.3 枳葛口服液含药血清对乙醇诱导L-02 肝细胞氧化损伤的抗氧化作用将细胞消化后对细胞进行计数使最终密度为2 × 105个/mL 并接种于6 孔板中，实验分为6 组，对照组（10%正常大鼠血清培养）、模型组（10%正常大鼠血清+2.5%乙醇培养）和4 组不同浓度的枳葛口服液含药血清（ZGG 1.25%、ZGG2.5%、ZGG5%、ZGG10%）与2.5%乙醇（YC2.5%）（即ZGG1.25% + YC2.5%组、ZGG2.5% +YC2.5%组、ZGG5%+YC2.5%组、ZGG10%+YC2.5%组）分别处理L-02 肝细胞24 h 后收集细胞。每组设6个复孔。

1.2.4 实验指标检测用CCK8 法检测细胞活力，同时采用硫代巴比妥酸法测定L-02 细胞中MDA的含量，采用荧光酶标仪检测ROS 水平，硫代巴比妥酸法测定细胞中SOD的活力。

1.3 统计学方法统计描述计量资料采用表示。计量资料均数之间的比较采用方差分析，组间两两比较采用最小差异显著法（least significance of difference，LSD法）。统计软件为SPSS 19.0，以P＜0.05 时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乙醇对L-02 肝细胞氧化损伤造模浓度及时间的筛选不同浓度乙醇干预6、12、24 h 后，细胞存活率随着乙醇浓度的增加及作用时间的延长呈逐渐下降趋势，当乙醇浓度为5%时，细胞存活率明显下降（P＜0.05，表1），而L-02 肝细胞内ROS、MDA 随着乙醇浓度的增加而升高，当乙醇浓度在2.5%～5%时，与对照组相比，干预24 h 后MDA、ROS 含量均明显升高（P＜0.05，表2、3）。结合细胞活力最终选取2.5%乙醇浓度作用24 h 复制L-02肝细胞氧化应激损伤模型。

2.2 不同浓度枳葛口服液含药血清对乙醇诱导L-02 肝细胞氧化损伤的抗氧化作用不同浓度的枳葛口服液含药血清与2.5%乙醇（即ZGG1.25%+YC2.5%组、ZGG2.5%+YC2.5%组、ZGG5%+YC2.5%组、ZGG10% + YC2.5%组）共孵育细胞24 h 后，与对照组相比：仅枳葛口服液含药血清最低剂量组（ZGG1.25% + YC2.5%组）的细胞存活率、细胞中MDA、ROS 及SOD 含量差异无统计学意义（P＞0.05），其余各组细胞存活率随着枳葛口服液含药血清浓度的增加呈逐渐下降趋势，但存活率均在75%以上（P＜0.05），且各组细胞中MDA、ROS 含量随着枳葛口服液含药血清浓度的增加呈逐渐增多趋势（P＜0.05），各组细胞中SOD 含量随着枳葛口服液含药血清浓度的增加呈逐渐减少趋势（P＜0.05），即枳葛口服液含药血清浓度越高，以上指标越接近于模型组（表4、5 及图1）。因此，1.25%枳葛口服液含药血清浓度对乙醇诱导L-02 肝细胞氧化损伤的抗氧化作用是最佳的。

表1 不同浓度乙醇干预6、12、24 h 后对L-02 肝细胞活力的影响（n=6）Tab.1 Effects of ethanol at different concentrations onthe cell viability of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s

表1 不同浓度乙醇干预6、12、24 h 后对L-02 肝细胞活力的影响（n=6）Tab.1 Effects of ethanol at different concentrations onthe cell viability of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s

注：与对照组相比，*P＜0.05

组别对照组0.5%乙醇组1%乙醇组1.5%乙醇组2%乙醇组2.5%乙醇组3%乙醇组5%乙醇组F 值P 值6 h存活率（%）0.944±0.019 0.935±0.024 0.941±0.008 0.934±0.005 0.938±0.008 0.934±0.004 0.839±0.028*0.774±0.022*119.096＜0.001 OD 值99.78±0.67 97.91±1.87 96.17±1.73*94.02±1.93*96.35±2.54*95.08±1.88*83.14±3.22*77.24±2.65*118.963＜0.001 12 h存活率（%）0.943±0.018 0.928±0.019 0.925±0.018 0.920±0.010*0.861±0.024*0.817±0.020*0.760±0.024*0.708±0.019*180.242＜0.001 OD 值100.00±0.00 94.81±1.74*92.53±1.73*90.83±1.45*83.80±2.20*81.14±1.86*75.62±1.86*70.98±1.89*307.479＜0.001 24 h存活率（%）1.020±0.052 0.990±0.050 0.941±0.008*0.875±0.017*0.837±0.023*0.792±0.022*0.753±0.031*0.633±0.021*148.625＜0.001 OD 值100.00±0.00 97.52±1.06*94.44±1.05*85.56±1.73*79.44±1.13*76.19±1.94*70.72±1.57*64.85±3.87*435.966＜0.001

表2 不同浓度乙醇干预6、12、24 h 后对L-02 肝细胞中MDA 含量的影响（n=6）Tab.2 Effects of ethanol at different concentrations on the MDA content of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s，nmol/mgprot

表2 不同浓度乙醇干预6、12、24 h 后对L-02 肝细胞中MDA 含量的影响（n=6）Tab.2 Effects of ethanol at different concentrations on the MDA content of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s，nmol/mgprot

注：与对照组相比，*P＜0.001

组别对照组0.5%乙醇组1%乙醇组1.5%乙醇组2%乙醇组2.5%乙醇组3%乙醇组5%乙醇组F 值P 值6 h 55.89±1.90 57.67±1.58 57.78±2.33 59.89±1.90*61.67±2.45*60.89±2.37*59.78±1.39*61.89±1.83*10.223＜0.001 12 h 60.78±1.92 59.33±2.00 62.22±2.63 61.78±2.17 60.11±2.20 62.56±3.28 60.33±2.50 61.67±2.12 2.013 0.067 24 h 59.22±2.28 61.67±2.34 61.33±2.91 77.44±1.51*85.11±3.48*114.11±6.09*127.00±3.67*158.44±4.61*908.340＜0.001

表3 不同浓度乙醇干预6、12、24 h 后对L-02 肝细胞中ROS 水平的影响（n=6）Tab.3 Effects of ethanol at different concentrations on the ROS content of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s，U/mg

表3 不同浓度乙醇干预6、12、24 h 后对L-02 肝细胞中ROS 水平的影响（n=6）Tab.3 Effects of ethanol at different concentrations on the ROS content of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s，U/mg

注：与对照组相比，*P＜0.001

组别对照组0.5%乙醇组1%乙醇组1.5%乙醇组2%乙醇组2.5%乙醇组3%乙醇组5%乙醇组F 值P 值6 h 90.33±2.00 91.33±2.12 92.22±2.73 91.00±2.74 90.89±2.03 91.78±2.44 90.44±2.19 91.67±2.45 0.714 0.661 12 h 89.33±1.58 89.78±1.72 91.67±3.28*91.44±1.59 91.89±2.57*92.22±2.44*92.22±2.91*91.67±2.12*1.981 0.071 24 h 90.22±2.44 92.00±2.12 92.78±2.49 94.33±3.24*95.11±3.18**138.00±4.12***183.33±4.24***218.33±6.73***1 527.655＜0.001

表4 不同浓度含药血清和2.5%乙醇共孵育24 h 后对细胞活力的影响（n=6）Tab.4 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the cell viability of cells after 24hours of incubation ±s

表4 不同浓度含药血清和2.5%乙醇共孵育24 h 后对细胞活力的影响（n=6）Tab.4 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the cell viability of cells after 24hours of incubation ±s

注：与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05

组别对照组模型组ZGG1.25%+YC2.5%组ZGG2.5%+YC2.5%组ZGG5%+YC2.5%组ZGG10%+YC2.5%组F 值P 值OD 值0.945±0.012b 0.792±0.022a 0.947±0.009b 0.857±0.031ab 0.732±0.024ab 0.666±0.032ab 211.797＜0.001存活率（%）99.78±0.67b 76.19±1.94a 99.33±1.14b 88.94±1.22ab 82.50±2.36ab 77.68±2.23ab 307.23＜0.001

表5 不同浓度含药血清和2.5%乙醇共孵育24 h 对细胞中MDA、ROS 及SOD 含量的影响（n=6）Tab.5 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the MDA，ROS and SOD content of cells after 24 hours of incubation ±s

表5 不同浓度含药血清和2.5%乙醇共孵育24 h 对细胞中MDA、ROS 及SOD 含量的影响（n=6）Tab.5 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the MDA，ROS and SOD content of cells after 24 hours of incubation ±s

注：与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05

组别对照组模型组ZGG1.25%+YC2.5%组ZGG2.5%+YC2.5%组ZGG5%+YC2.5%组ZGG10%+YC2.5%组F 值P 值MDA（nmol/mgprot）59.00±2.60b 106.22±4.32a 58.44±3.97b 79.89±4.83ab 90.22±6.14ab 102.00±7.02a 186.097＜0.001 ROS（U/mg）90.33±2.91b 152.00±6.24a 89.11±4.86b 97.89±7.42ab 99.56±7.18ab 140.89±10.08ab 146.175＜0.001 SOD（mg/L）86.00±6.42b 46.51±2.25a 83.11±6.97b 71.22±6.33ab 53.13±5.12ab 48.32±4.25a 216.363＜0.001

图1 不同浓度含药血清和2.5%乙醇共孵育24 h 对细胞中MDA、ROS 及SOD 含量的影响Fig.1 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the MDA，ROS and SOD content of cells after 24 hours of incubation

3 讨论

正常条件下，肝脏本身含有如SOD、过氧化物酶、谷胱甘肽等抗氧化剂以清除多余的自由基，使细胞氧化系统和抗氧化系统保持相对平衡以保护肝细胞免受损伤［11-12］。ALD 中，乙醇诱导的氧化应激产生大量ROS和活性氮自由基团，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致肝脏损伤［13-14］；同时，当大量乙醇进入体内，通过代谢转化为大量乙醛与肝细胞中的蛋白质、DNA 发生整合，形成乙醛加合物，使机体ROS增多，氧化应激水平升高，导致脂质过氧化，MDA增高，某些抗氧化物质如SOD等大量消耗，削弱机体多个器官特别是肝脏的抗氧化能力，进一步加重肝脏氧化应激损伤［15］。本实验结果显示，2.5%乙醇干预L-02 肝细胞24 h 导致细胞活力减弱，细胞内SOD 酶活力明显降低（P＜0.05），MDA、ROS含量均明显升高（P＜0.05），说明2.5%乙醇干预L-02 肝细胞24 h 成功诱导氧化应激损伤，导致脂质过氧化，抗氧化物质SOD 消耗，削弱了肝脏本身的抗氧化能力，这与其他相关实验一致［16-17］。

枳葛口服液方剂由枳椇子、山楂、葛根等六味中药组成，其中枳椇子、葛根为君药，二者均有解酒毒、生津解郁之功效［18-19］，研究表明葛根素预防性给药能使急性乙醇中毒大鼠海马及下丘脑SOD活性增高，MDA 含量降低，葛根素对酒精引起的机体内氧化反应有明显拮抗作用，可对脑组织细胞起到保护的作用［20］。据现代药理研究表明：ALD发病机制中乙醇及其代谢产物——活性氧及毒素MDA等对肝脏产生毒性作用是罪魁祸首，而葛花枳椇子均可降低血液中的乙醇浓度［21-22］，本研究结果显示，不同浓度的枳葛口服液含药血清与2.5%乙醇（即ZGG1.25% + YC2.5%组、ZGG2.5% +YC2.5%组、ZGG5%+YC 2.5%组、ZGG10%+YC2.5%组）共孵育L-02 肝细胞24 h 后，各组与模型组比较，不管是细胞活力还是氧化应激指标MDA、ROS及抗氧化酶SOD等指标均有所改善，且改善程度与枳葛口服液含药血清浓度呈负相关，即浓度最小组（ZGG1.25% + YC2.5%组）逆转乙醇诱导L-02肝细胞氧化损伤的效果最佳，浓度最小组的以上指标与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。可见枳葛口服液含药血清可使L-02 肝细胞内抗过氧化酶水平升高，从而提高其抗氧化能力，从而对乙醇诱导的氧化应激损伤有明显拮抗作用，其中，1.25%枳葛口服液含药血清浓度对乙醇诱导L-02肝细胞氧化损伤的抗氧化作用最佳。

综上所述，一定剂量的枳葛口服液对乙醇诱导的氧化应激损伤具有一定的阻止及逆转作用，其机制可能与该复方药物多靶点、多途径共同协同进行降酒毒，增加细胞内抗氧化酶SOD的活力，清除或降低已吸收乙醇代谢所产生的毒物——MDA、ROS 含量，从而最终达到有效预防ALD的发生发展。