PTGER4 基因多态性与广西壮族、汉族人群炎症性肠病的关系

徐小芳 梁赵良 曾睿智 吕晓丹 刘耿峰 吕小平

广西医科大学第一附属医院（南宁530021）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）主要分为溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn′s disease，CD）两种类型，其发病率在全球呈上升趋势，我国的发病率也正逐年上升［1］。IBD的病因尚不明确［2］，普遍认为是肠道的上皮细胞、共生的微生物群、黏膜免疫系统之间的三者关系失调导致慢性炎症的发生，这三者又受到遗传和环境因素的影响［3］。

目前已证实了200多个IBD易感性基因位点［4］，其中大多数是在基因编码区。LIBIOULLE等［5］发现5p13.1 基因多态性与CD的易感性有关，它是一段1.25-MB的基因非编码区，与CD 相关的遗传变异能上调PTGER4的表达水平，其中rs4495224和rs7720838 基因多态性与CD 关系较强，对PTGER4表达的影响最为显著，常将PTGER4基因作为CD的易感基因。另有学者发现PTGER4与早发型UC易感性有关［6］。PTGER4基因可以编码产生EP4亚基［7］，EP4 作为前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的受体与其结合导致了白细胞的募集和炎症介质的产生，参与了肠道炎症的发生和缓解作用［8］。近年来，非基因编码区的疾病易感基因越来越受到关注，研究［9］表明非编码RNA 在炎症性肠病细胞免疫调节起重要作用。目前该基因多态性与IBD的研究国内外报道尚不一致，GLAS等［10］、PRAGE等［11］发现rs4495224和rs7720838 基因多态性与法国、比利时、德国、北美人群CD的易感性有关，与UC 无关。但在日本人群并未发现以上两个位点与IBD 有关［12］。郭政等［13］通过Meta分析发现rs4495224 基因多态性与CD 无明显关联。我国尚无该基因多态性与IBD 相关的临床研究报道，广西是我国壮族人口最大的聚居地，壮族、汉族人群拥有不同的疾病遗传性［14］。本研究目的是探讨PTGER4rs4495224和rs7720838 多态性与广西壮族、汉族人群IBD 以及临床特征的相关性，为IBD的基因诊断及治疗提供线索。

1 资料和方法

1.1 临床资料收集2014年5月至2018年11月在广西医科大学第一、第二附属医院消化内科门诊、住院的广西区域无血缘关系的IBD 患者212例（UC 组：壮族59例，汉族69例；CD 组：壮族40例，汉族44例）。IBD的诊断符合2018年制定的《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》的诊断标准［15］，并排除患有其他自身免疫性疾病、感染性肠炎患者。另收集广西区域无血缘关系的健康对照者190例（壮族90例，汉族100例）。纳入对象为同期就诊于广西医科大学第一、二附属医院，均已排除肿瘤、自身免疫性疾病及IBD 家族史的健康体检者。IBD 组和正常对照组年龄及性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。标本采集经医院伦理委员会批准和患者本人或家属知情同意。

1.2 研究方法（1）DNA 提取：采用DNA 试剂盒提取肠黏膜DNA。（2）位点的选择：从NCBI 获取SNP 信息，选择的SNP 最小等位基因频率（MAF）＞15%，结合文献报道，所选SNP 可能与CD的并发症有关。（3）PCR 扩增：①引物设计：根据NCBI 基因数据库设计rs4495224和rs7720838 位点引物，序列见表1。②PCR 反应体系：DNA2 μL+上下游引物各1 μL + Master Mix 25 μL + RNase-free Water 21 μL。③反应条件：变性94 ℃、30 s，退火50 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，共30个循环，72 ℃继续延伸7 min。④基因测序：电泳鉴定目的片段，并将PCR产物送测序，用Chromas 软件判读基因型。

1.3 统计学方法采用SPSS 24.0 统计学软件进行分析。统计rs4495224和rs7720838 位点的基因型及等位基因频率，采用Hardy-Weinberg 遗传平衡性检验，P＞0.05 提示具有群体代表性。用χ2检验或Fisher 确切概率法检验比较组间各基因型和等位基因频率以及分析基因多态性与临床特征的差异，P＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 结果

2.1 rs4495224 基因多态性分析结果PCR 产物电泳条带与目的片段大小一致。测序结果与Gen-Bank 基因库上序列一致。共得到3种基因型：野生型纯合子CC 型、突变型杂合子AC 型和突变型纯合子AA 型。

基因型及等位基因频率分布见表2、3。各组基因型及等位频率分布符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P＞0.05），具有群体代表性。汉族CD 组突变基因型（AA+AC）频率、A 突变等位基因频率明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P=0.002；P=0.001）；壮族UC 组、CD 组、汉族UC 组分别与正常对照组比较、壮族CD 组与汉族CD 组比较、壮族CD 组与汉族CD 组比较基因型及等位基因频率分布均差异无统计学意义（P＞0.05）；进一步分析rs4495224 多态性与汉族CD 临床特征（病变部位、疾病活动性、有无并发症）的关系，CD 病变部位分为：回肠末段（L1）、结肠（L2）、回结肠（L3）；依据简化克罗恩活动指数计算法将疾病活动性分为：缓解期、活动期；并发症包括：瘘管、腹腔脓肿、肠腔狭窄和肠梗阻、肛周病变等［15］。在汉族CD的不同病变部位、疾病活动性、有无并发症其基因型和等位基因频率的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 rs7720838 基因多态性分析结果PCR 产物电泳条带与目的片段大小一致。测序结果与Gen-Bank 基因库上序列一致。共得到3种基因型：野生型GG 型、杂合子突变TG 型和纯合子突变TT 型。

基因型频率及等位基因频率分布见表4、5。各组基因型及等位频率分布符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P＞0.05），具有群体代表性。汉族CD组突变基因型（TT + TG）频率、T等位基因频率明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P=0.015；P=0.006）；汉族CD 组T等位基因频率（29.5%）高于壮族CD 组（15%），差异有统计学意义（P=0.028），二者的基因型频率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。壮族UC 组、CD 组、汉族UC 组分别与正常组比较、壮族UC 组与汉族UC 比较基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义（P＞0.05）；在汉族CD 患者的不同病变部位、疾病活动性、有无并发症中基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 rs4495224 病例组与对照组基因型频率和等位基因频率Tab.2 rs4495224 genotype and allele frequency in case group and control group

表3 rs4495224 汉族CD 组基因-临床特征分析Tab.3 rs4495224 gene-clinical characteristics analysis in Han CD group

3 讨论

PTGER4基因编码产生PGE2的受体EP4 亚基，其广泛表达于骨髓、结肠、小肠、胃等组织。PGE2 是花生四烯酸（arachidonicacid，AA）以环氧合酶（COX）为限速酶而产生的代谢产物之一，它通过与四种受体亚型（EP1-EP4）结合，参与急性炎症和炎症性免疫疾病的发生和发展［8］。既往研究发现PGE2的促炎作用主要通过EP1和EP3受体介导，EP4 通过激活抗凋亡和增殖信号通路，对结肠上皮细胞的存活和再生有重要作用［16］，NAKASE等［17］发现EP4 激动剂能抑制结肠炎发展并促进粘膜愈合。但有研究发现，PGE 2 可以通过EP2/Ep4 受体增加IL-12和IFN-γ信号通路促进Th1细胞分化；通过IL-1β和IL-23 通路促进体外Th17细胞增殖［8］。既往研究报道Th1、Th17 这两种辅助性T 细胞和IBD的发生、发展有关［18］。另外，GLAS等［10］发现核转录因子（NF-κB）和X 盒结合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）可能分别与5p13.1某基因组区域结合从而上调PTGER4表达进而影响IBD的发病。其中转录因子NF-κB 参与多种炎症信号通路［19］，肠上皮细胞中XBP1的缺失导致自发性肠炎［20］，二者都参与IBD的发病。近年来PTGER4基因被发现与多种其他自身免疫性疾病有关，如强直性脊柱炎（rs7726237）［21］、多发性硬化症（rs9292777）［22］、类风湿关节炎（rs76523431）［23］等，其发病机制可能是PGE2 在体内通过EP4 受体促进辅助性T 细胞的功能，促发免疫炎症的发生。研究［24］表明使用EP4 选择性拮抗剂可减少局部淋巴结中Th1和Th17 细胞的积累，并抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎或接触性过敏小鼠的疾病进展。因此EP4 拮抗作用可能是治疗难治性免疫疾病的良好药物靶点。

表4 rs7720838 病例组与对照组基因型频率和等位基因频率Tab.4 rs7720838 gnotype and allele frequency in case group and control group

表5 rs7720838 汉族CD 组与基因-临床特征分析Tab.5 rs7720838 gene-clinical characteristics analysis in Han CD group

本研究发现PTGER4基因rs4495224和rs7720838多态性与广西汉族人群CD的易感性相关，但与壮族CD、汉族和壮族UC 无关。rs4495224 A和rs7720838 T 危险等位基因可能增加汉族CD 人群PTGER4的表达，ER4 受体增加与PGE2 结合促进Th1 细胞分化、Th17 细胞增殖，各种促炎因子如IFN-γ、TNF-α、IL-17等分泌增加参与CD的病理改变。本研究中汉族的研究结果与LIBIOULLE等［5］、GLAS等［10］、PRAGE等［11］的报道一致，但与日本人群的报道相悖。汉族与壮族CD 组的基因型和等位基因频率对比，发现携带rs7720838 T等位基因的汉族人群患CD 风险比壮族高，但在rs4495224中并无此发现。中国是一个有56个民族的国家，相同种族不同民族IBD的发病率和患病率存在差异，唐源等［25］发现在云南省18个不同少数民族中，汉族人群的总患病率和UC 患病率均最高。本研究中汉族和壮族的结果不同可能是不同民族受个体遗传背景影响，也可能与不同民族的经济发展水平、居住环境和生活习惯不同有关。本研究基因-临床特征分析显示，rs4495224和rs7720838基因多态性与广西汉族CD的病变部位、疾病活动度、有无并发症无关联，这一结果与GLAS等［10］、PRAGE等［11］关于基因-临床特征、基因-基因的关系研究不一致。这些结论受到小样本和地理区域的限制，还需要进一步研究。本研究未发现rs4495224和rs7720838 与汉族UC 及壮族UC和CD发病相关，因此没有进一步研究基因多态性与临床特征的关系。

综上，PTGER4基因rs4495224和rs7720838 多态性可能与广西汉族人群CD 易感性有关，可能与汉族CD的病变部位、疾病活动性、有无并发症无关，可能与汉族UC、壮族CD 及UC 易感性无关；携带rs7720838 T 突变等位基因的汉族人群患CD 风险可能比壮族高。然而本研究样本量较少、所纳入的临床特征分组过少、汉族与壮族人群的结果不一致，尚不能得出可靠结论，还需更大规模的研究去证实；由于CD 病因和发病机制复杂，后续工作需进一步研究PTGER4基因具体通过何种途径参与CD 炎症病理性改变。