间充质干细胞对脂多糖刺激下肺微血管内皮细胞增殖及周期的影响

陈旭昕 汪文婧 胥颉 唐俭 孟激光 韩志海

1中国人民解放军总医院第六医学中心呼吸与危重症医学科（北京100048）；2安庆市立医院心胸外科监护病房（安徽安庆246003）；3黑龙江省大庆市杜尔伯特蒙古族自治县中医医院内科（黑龙江大庆166200）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）及急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是临床常见的急危重症，目前缺乏特异性治疗手段，病死率仍居高不下［1-2］。肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cell，PVEC）对于维持肺泡-毛细血管膜的功能、肺泡水肿液的清除至关重要，PVEC 广泛损伤将加速ALI/ARDS的发生发展［3-4］。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）来源广，可从骨髓、脂肪组织、脐带血、皮肤、肌肉、肌腱及牙髓等组织中获得［5］。研究表明，骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BM-MSC）在急性肺损伤动物模型中有治疗作用［6］，体外实验也证实BMMSC 对PVEC 具有保护作用［7］，但具体的机制尚未完全明了，可否通过调控PVEC 细胞周期来发挥保护作用尚无直接证据。因此，本研究拟利用Transwell共培养体系，用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激PVEC，观察BM-MSC 对PVEC 细胞增殖及周期的影响，并分析细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、细胞周期蛋白依赖激酶4（Cyclin-dependent kinase 4，CDK4）及P27的表达水平，以期为BM-MSC 在ALI/ARDS 治疗中的应用提供更多实验室依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂人源性BM-MSC 细胞来源于广州赛业生物科技有限公司，由提供商完成干细胞免疫表型及多能分化潜能鉴定。人源性PVEC 细胞来源于美国模式培养物集存库。LPS（Ecoil 0111：B4）购于美国Sigma。DMEM/F12 培养基和优质胎牛血清均购于GIBCO 公司。CCK-8 试剂盒及细胞周期检测试剂盒均购自碧云天生物技术公司。Trizol 来源于美国Invitrogen 公司。逆转录试剂盒及荧光实时定量PCR 试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。Transwell 细胞共培养板（含0.4 μm 孔径滤膜）购置美国康宁公司。其他生化试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 人BM-MSC 及PVEC 细胞培养人BM-MSC及PVEC 细胞均培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12 培养基中，培养条件为：37 ℃、5% CO2及95%湿度。每隔1 d 换液1次，2～3 d 传代1次。实验用细胞均处于对数生长期。

1.3 细胞共培养及分组处理BM-MSC 与PVEC细胞共培养于Transwell 共培养体系中。Transwell 体系的上室接种BM-MSC（1 × 105/孔），而在下室接种PVEC（2 × 103/孔），建立共培养体系，同上条件常规培养。实验分4 组：A 组：正常PVEC 组，PVEC 细胞常规培养不予以任何刺激；B 组：PVEC+LPS 组，PVEC 细胞常规培养同时给予终浓度为0.1 mg/mL的LPS 刺激6 h；C组：PVEC/BM-MSC+LPS 组，将BM-MSC 与PVEC细胞共培养于Transwell 体系过夜后给予0.1 mg/mL的LPS 刺激6 h；D 组：PVEC/BM-MSC + PBS组，同上将BM-MSC 与PVEC 细胞共培养于Transwell 体系过夜后，用等体积的PBS 代替LPS，再孵育6 h。

1.4 CCK8 法检测PVEC 细胞增殖情况细胞增殖实验中采用96 孔的Transwell 共培养板，同上分组及处理细胞，在结束培养前，每孔中加入10 μL CCK8 溶液。并设立3个复孔及空白对照孔。加入CCK8 溶液后继续在细胞培养箱内孵育1 h，用酶标仪测各孔波长在450 nm的吸光度值，以吸光度值表示细胞的增殖水平。

1.5 PVEC 细胞周期检测细胞周期检测实验中采用6 孔的Transwell 共培养板，同上分组及处理细胞。培养结束时，常规消化处于下室的PVEC 细胞，PBS 洗涤细胞后，用4 ℃的70%（v/v）固定细胞12 h。加入等体积的PBS 洗涤两遍，再加入终浓度20 μg/mL的RNase，37 ℃水浴1 h，离心去上清，悬浮于PI 染液中，室温下避光染色15 min，流式细胞仪检测，MCYCLE 软件分析细胞周期。

1.6 PVEC 细胞内CyclinD1、CDK4 及P27 mRNA表达水平检测同时处理并收集PVEC 细胞，按5×106个细胞加入1 mL Trizol的比例加入Trizol 并混匀。Trizol 一步抽提法提取总RNA。按反转录试剂盒说明进行反转录，并按实时定量PCR 试剂盒说明进行PCR，PCR 条件如下：95 ℃，预变性30 s；随后进行40个循环PCR 反应（95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s）；60 ℃延伸30 s；最后60～95 ℃进行熔解曲线检测。以β-actin 作为内参基因。目的基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法进行定量分析。扩增引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列如下：β-actin：5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3′（正义链），5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′（反义链）；Cyclin D1：5′-GATGCCAACCTCCTCAACGAC-3′（正义链），5′-CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC-3′（反义链）；CDK4：5′-ACCAGATGGCACTTACACCC-3′（正义链），5′-TCCACAGAAGAGAGGCTTTCG-3′（反义链）；P27：5′-CTCTGAGGACACGCATTTGGTGGA-3′（正义链），5′-GGCATTTGGGGAACCGTCTGAAAC-3′（反义链）。

1.7 统计学方法应用统计软件SPSS 13.0进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，各组间均数比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用SNK 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BM-MSC共培养对PVEC细胞增殖的影响与A 组相比，B，C 及D 组的细胞增殖率下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；而与B 组比较，与BMMSC 共培养的C，D 组细胞增殖率提高，而与A 组比较，D 组的细胞增殖率升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组PVEC的细胞生长曲线Fig.1 The cell growth curve of PVECs in each group

2.2 BM-MSC共培养对PVEC细胞周期的影响A 组细胞周期分析显示：S 期细胞比例为（30.17±0.98）%，（G1+G2）期细胞比例为（69.83±0.98）%；而B 组细胞，S 期细胞比例显著减少为（15.77±0.77）%，（G1 + G2）期细胞比例显著增加为（84.22±0.77）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；BM-MSC共培养则可缓解LPS 诱发的（G1+G2）期细胞比例的增加以及S 期细胞比例的减少，差异有统计意义（P＜0.05）。而D 组与A 组比较，S 期细胞比例进一步增加为（34.48±0.65）%，（G1 + G2）期细胞比例进一步下降为（65.53±0.65）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 流式细胞仪检测细胞周期Fig.2 Analysis of cell cycle by flow cytometry

2.3 BM-MSC 共培养对PVEC 中细胞周期相关蛋白mRNA 表达水平的影响与A 组相比，B 组细胞内P27 mRNA 表达水平显著上升，而CyclinD1及CDK4 mRNA 表达水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；而在C 组，P27 mRNA 增加和CyclinD1及CDK4 mRNA 减少的程度均较B 组减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；而与A 组比较，D 组的CyclinD1 及CDK4 mRNA 增加和P27 mRNA 下降的程度，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

3 讨论

PVEC 是肺泡-毛细血管膜重要的组成细胞，在维持肺内环境的平衡与稳定中起重要作用［8］。PVEC 通透性的增加将加速肺泡水肿液的形成及炎症细胞浸润［9］。本研究首次从细胞周期阻滞角度阐述了BM-MSC 对PVEC的保护机制，结果显示与BM-MSC 共培养可减轻LPS 对PVEC 增殖的抑制作用以及周期的阻滞效应，这可能与调控细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK4 及P27的表达有关。

图3 实时定量RT-PCR 检测PVEC 细胞内CyclinD1、CDK4及P27 mRNA 表达Fig.3 Analysis of CyclinD1，CDK4 and P27 mRNA levels in PVECs by qRT-PCR

细胞周期是指从细胞分裂产生的新细胞开始到下一次分裂形成细胞结束为止所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段［10-11］。细胞周期中存在G1/S和G2/M 两个重要的调控阻滞点，一旦细胞将不能从一个阶段转向下一个阶段将发生细胞周期阻滞，从而导致细胞无法增殖更新［12-13］。肺泡-毛细血管膜的修复需要肺血管内皮细胞增殖，而细胞增殖依赖于细胞周期的循环。调控细胞周期或细胞周期相关蛋白可作为ALI/ARDS的治疗靶点［14］。本研究发现与BM-MSC共培养后，PVEC的S期细胞比例上升，而（G1+G2）期的细胞比例减少，这可能是BM-MSC共培养促进PVEC细胞增殖的机制之一。

细胞周期正性调控蛋白包括Cyclin和CDK［15］。细胞能否通过调控阻滞点而进入细胞自主分裂程序，很大程度取决于G1 期内CyclinD1的积累，上调CyclinD1及CDK4的表达可推动细胞通过调控阻滞点，而阻滞CyclinD1 及CDK4的表达可使细胞不能从G1 期进入S 期［16］。而P27 是重要的细胞周期负性调控因子［17］。P27 可与Cyclin 结合而对Cyclin/CDK 复合物起抑制作用，最终抑制细胞周期的循环［18］。本研究结果显示，与BM-MSC 共培养后促进CyclinD1及CDK4的表达，而减少P27的表达。目前BM-MSC 发挥效应的主要机制被认为与其旁分泌功能有关［19］，本研究中采用的是Transwell 细胞非直接接触共培养体系，因此笔者推测BM-MSC 亦可能是通过旁分泌机制对细胞周期相关蛋白进行调控，具体通过何种旁分泌因子来实施对细胞周期相关蛋白的调控尚有待进一步研究探索。

此外，本研究显示，在非炎症刺激环境下BMMSC 共培养对PVEC的增殖、细胞周期及细胞周期相关蛋白也有正性调控作用，这可能与BM-MSC在静息状态下亦能旁分泌可溶性有益因子有关［20］。后续实验将考虑采用细胞因子阵列分析等手段来检测可溶性细胞因子的差异表达，以进一步探索发挥此效应主要归因于何种细胞因子。

综上，BM-MSC 对PVEC 细胞存在保护作用，促进PVEC 在炎症刺激环境下增殖，抵制细胞周期阻滞以及调控细胞周期相关蛋白表达是可能的分子机制，实验结果为进一步明确BM-MSC的保护机制提供了实验室依据。