肺炎克雷白杆菌II型分泌系统GspD-k生物信息学分析

王 霞，王廷璞，王弋博，赵天宇

（天水师范学院 生物工程与技术学院，化学工程与技术学院；甘肃 天水 741001）

肺炎克雷白杆菌(Klebsiella pneumoniae)是一种常见的革兰氏阴性致病菌，属于肠杆菌科(Entero⁃bacteriaceae)克雷白菌属(klebsiella)，1882年由Frie⁃diander从患大叶性肺炎患者的肺组织中首次分离得到。[1]75%～86%克雷白菌属导致的感染是由肺炎克雷白杆菌所导致，侵袭性克雷白杆菌感染的病死率为17.5%～23.0%，[2-4]其为医院内感染的重要致病菌之一。其生物学特征为兼性厌氧型，形态粗短杆菌，无鞭毛，有较厚的荚膜。多数菌株有菌毛,具有菌体抗原(O抗原)、荚膜抗原(K抗原)、菌毛抗原等多种主要抗原成分，但是不具备运动的能力。然而目前对肺炎克雷白杆菌的致病机理的研究鲜有报道。

II型分泌系统（T2SS）广泛存在于致病菌革兰氏阴性细菌中，T2SS负责分泌从周质到细胞外环境中的折叠蛋白。[5]T2SS是由一个简单的操纵子编码的12～15个称之为Gsp(General secretory pathway)蛋白（Escherichia coli）组分组成，[6]T2SS包括四部分：一个外膜复合体，一个周质pseudopilus，一个内膜基底层和一个胞质ATP酶。外膜复合物主要由GspD蛋白组成，内膜基底层通常是由至少4个膜蛋白组成，比如GspC,GspF,GspL和GspM，周质假纤毛结构主要由GspG组成，GspE主要是胞质ATP酶的组分。[7-8]有研究表明植物病原细菌通过T2SS分泌降解植物细胞壁的酶及多种毒性因子，破坏寄主细胞，导致组织坏死。[9]此外，T2SS在细菌的致病过程中同样具有举足轻重的作用。[10-11]这就说明II型分泌系统与细菌致病性之间有着密切关系。为了揭示其致病机制打下良好基础，深入研究肺炎克雷白杆菌GspD-k的功能，我们对II型分泌系统中外膜复合物组分GspD-k进行生物信息等方面的分析研究。

1 材料与方法

1.1 数据来源

数据为NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得肺炎克雷白杆菌的GspD-k基因及氨基酸序列（表1）。

1.2 肺炎克雷白杆菌GspD-k和大肠杆菌GspD序列比对分析

一方面在NCBIBlast中将GspD-k和GspD序列进行比对，另一方面在Clustalw中先进行比对，再通过ESPript网站输出比对的保守氨基酸序列（表1）。

1.3 GspD-k蛋白理化参数计算

按照软件Protparam所提示的要求，将GspD-k蛋白序列输入正确的格式，点击计算，从而获得该蛋白的基本理化性质（表1）。

1.4 GspD-k的氨基酸序列的功能结构预测分析

GspD-k信号肽序列的有无采用SignalP 4.1在线软件进行分析（Petersen etal.,2011），采用TMHMM Server v.2.0软件进行蛋白跨膜分析（韩丽珍等，2014）；采用软件PSORT和TARgetP对GspDk进行细胞内定位分析（表1）。

1.5 GspD-k蛋白二级结构及三维结构模型预测评估

蛋白质的结构包括α-螺旋和β-折叠、β-转角，无规卷曲和连接几种结构的延伸链。在线软件PredictProtein来预测GspD-k氨基酸序列二级结构；在线软件Phyre 2分析GspD-k氨基酸序列的三维结构模型（表1）。

表1 GspD-k生物信息分析在线软件网址

2 结果与分析

2.1 肺炎克雷白杆菌T2SS组分GspD-k基因座位分析

通过在NCBI网站分析发现肺炎克雷白杆菌中T2SS组分中GspE-k基因座位的为CDK79923，GspC-k的是CDK79921，GspG-k对应的基因座位为CDK77150，GspD-k对应的基因座位为CDK77145，从基因座位序列看，肺炎克雷白杆菌T2SS中GspD-k的基因座位并没有很紧密的和GspE-k紧靠在一起，研究的较为清楚的大肠杆菌中T2SS组分GspD和GspE都是紧密相邻，且与其他组份都排列在一起形成一个基因簇。这说明肺炎克雷白杆菌T2SS组分GspD-k在基因座位排列中有一定的独特性。

2.2 GspD-k氨基酸序列的理化性质分析

将GspD-k的蛋白序列输入ProtParam在线软件，分析结果显示该蛋白总共654个氨基酸，其总分子量为71132.66 Da；其等电点偏酸，达5.41.在氨基酸组成中（表2），GspD-K含有20种氨基酸，含量较为丰富的是亮氨酸（9.9%）、缬氨酸（9.5%）；色氨酸的含量最少，仅为0.5%；不含吡咯赖氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）。对蛋白序列中的氨基酸残基带电性质进行分析表明，其中带正电荷残基（精氨酸和赖氨酸）达65，带负电荷的（天冬氨酸和谷氨酸）为75个。

表2 GspD-K蛋白氨基酸组成

2.3 GspD-k与大肠杆菌GspD氨基酸序列比对

目前大肠杆菌中的GspD蛋白的研究较为清楚，GspD具有474个氨基酸，如上所述肺炎克雷白杆菌GspD-k有654个氨基酸。在NCBIblast中对二者进行比对，发现二者的相似性为59%.另外，为了找到与GspD相似的保守氨基酸位点，我们在clustalw在线网站对GspD和GspD-k蛋白的氨基酸序列进行比对，最后在ESPript中做出如下所示结果图片（图1）。结果显示红色区域为一致的氨基酸，属于二者保守的序列。但还需要对其保守位点进一步做突变确定关键的氨基酸位点。

2.4 肺炎克雷白杆菌T2SS组分GspD-k保守结构域分析

在CD Search上的分析表明GspD-K氨基酸序列有一个属于Secretin superfamily的保守结构域。进一步通过SMARTPfam domain在线网站预测结果如下图2所示，GspD-K氨基酸序列有4个保守结构域，分别是3个Secretin_N结构域，1个Secretin结构域，3个Secretin_N结构域所处氨基酸序列分别为 131aa～193aa,196aa～268aa,272aa～351aa.Secretin结构域为473-599aa.

2.5 GspD-k蛋白的功能结构的预测和分析

有些蛋白质的氨基酸N端带有信号肽，一半长度为15～30个氨基酸。信号肽的预测有助于确定该蛋白的亚细胞的定位。同时还能为蛋白肝功能域的划分提供较为可靠的参考；以D-cutoff=0.450，用SignalP 4.1预测信号肽（图3），结果显示最大的Y（Max.Y） 值为 0.541，最大的 S（Max.S） 值为0.900，S的平均值（mean S）为0.783，表明GspD-k含有信号肽序列，并且信号肽序列为1～27aa.这说明GspD-k是分泌蛋白。

图1 GspD-k与大肠杆菌GspD氨基酸序列比对

图2 肺炎克雷白杆菌T2SS组分GspD-k保守结构域分析

蛋白的跨膜分析软件TMHMM Server v.2.0对该多肽生物信息预测显示（图4），其跨膜螺旋个数为0，跨膜螺旋氨基酸残基数量的期望值为1.16685（超过18个，可能含跨膜螺旋或者含有信号肽），而蛋白前60个氨基酸中跨膜螺旋的氨基酸数量的期望值0.39516，N端位于膜细胞质侧的总概率为0.05693.蛋白位于细胞膜外侧的可能性是1左右，综上所述，推测GspD-K蛋白可能位于细胞膜外，不具有跨膜螺旋。PSORT亚细胞定位软件则进一步明确该蛋白定位于外膜上（表3）。

利用ProtScale分析GspD-k蛋白的亲疏水性，结果表明（图5）疏水氨基酸所占比例为44.95%，亲水性氨基酸所占比例为53.82%.其中，疏水性最强的是第17位的丙氨酸，其值为2.856；亲水性最强的是第618位的谷氨酰胺，其值为-3.589.由于亲水性区域较大于疏水性区域，因此，我们认为GspD-k蛋白为偏亲水性蛋白。

2.6 GspD-k蛋白二级和三级结构预测分析

利用PredictProtein软件分析Gsp-K蛋白的二级结构。结果表明表α-螺旋的比例是21.87%，β-折叠的比例是24.01%，无规则Loop环所占比例为54.13%（表4）。即无规则loop环是GspD-k蛋白中主要组成原件（图6）。这有利于蛋白结构的稳定。

图3 SignalP 4.1预测Gsp-k蛋白的信号肽

图4 TMHMM对GspD-k蛋白跨膜性分析

表3 PSORT对GspD-k蛋白亚细胞定位分析

图5 ProtScale预测GspD-k蛋白的亲疏水性

运用phyre2对GspD-k蛋白的三级结构进行模拟预测（图7），氨基酸序列从氨基端到羧基端以箭头表示。预测结果和c5WQ9L蛋白（II型分泌系统D蛋白）的三级机构模型相似性为47%.其模型三维分别用X,Y和Z来表示。X值为38.442，Y值为90.604,Z值为196.293.

表4 GspD-k蛋白二级结构预测

3 结 论

应用生物信息学的方法，对肺炎克雷白杆菌II型分泌系统组分GspD-k基因及其蛋白序列结构和功能进行分析，发现GspD-k为含有信号肽序列并存在于细胞膜上的较为稳定的外膜蛋白。此外GspD-k蛋白中的二级结构主要有三种，即α-螺旋，β-折叠和无规则Loop环，Loop环占主要比例。本研究为深入研究肺炎克雷白杆菌GspD-k的功能及其致病机制提供理论基础。

图7 phyre2预测GspD-k蛋白三级结构