翼状胬肉与睑裂斑组织病理结构及磷酸化细胞外信号调节激酶、含IQ模序的GTP酶活化蛋白1表达的对比研究

董舒婷 彭娟 沙翔垠 姚达强 戴棐曌 毛雁

广州医科大学附属第二医院（广州510260）

翼状胬肉主要表现为局部球结膜纤维血管呈三角形增生并侵犯角膜［1］，轻则影响美观，重则影响视力。主要采用手术的方式治疗［2］，发病机制较复杂，目前尚不明确。

睑裂斑是位于睑裂区鼻侧或颞侧的结膜的良性的病变，呈黄色，轻微隆起［3］，一般无不适，通常不予处理，部分人因影响美观或反复出现眼红、眼痒等炎症症状而手术切除。与翼状胬肉相比，睑裂斑的范围一般仅局限于结膜，通常不会侵犯角膜。目前国内外关于睑裂斑发病机制的研究较少，有学者认为翼状胬肉可由睑裂斑演变而来。

翼状胬肉与睑裂斑是与紫外线暴露相关常见的眼表疾病，均有较高的发病率，发病机制均尚不明确。研究表明，翼状胬肉中细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路异常激活，可能与翼状胬肉上皮细胞的增殖相关，p-ERK 即磷酸化的细胞外信号调节激酶。含IQ 模序的GTP 酶活化蛋白1（IQGAP1）是一种GTP 酶活化蛋白，参与多种重要的细胞活动，如细胞骨架结构、细胞间的黏附、细胞迁移和信号转导。本研究通过比较翼状胬肉与睑裂斑组织病理改变的差异，以及p-ERK、IQGAP1在翼状胬肉和睑裂斑组织中的表达差异，探讨两者的发病机制的异同。旨在加深对翼状胬肉、睑裂斑两种常见的眼表疾病的认识，以及探讨两者的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2018年1～6月在广州医科大学附属第二医院眼科行翼状胬肉切除联合结膜瓣转位加角膜缘干细胞移植术的翼状胬肉患者及行单纯睑裂斑切除术的睑裂斑患者，前者为8 例8 眼的单眼翼状胬肉标本，男2 例，女6例。后者为8 例8 眼的单眼睑裂斑标本，男3 例，女5 例。8 例正常结膜组织取自眼库中捐献者死后24 h 内正常眼的非角膜缘结膜组织。患者术前均签署知情同意书，所有试验均遵循赫尔辛基宣言，并通过医院伦理委员会审查。

1.2 翼状胬肉及睑裂斑病理组织观察将翼状胬肉组、睑裂斑组、正常结膜组3 组织标本固定在40%多聚甲醛，常规脱水、石蜡包埋，作4 μm 连续切片，进行HE 染色，在光学显微镜下观察标本各层次组织结构，对翼状胬肉与睑裂斑病理表现进行比较：（1）先在低倍镜（× 100）下确定上皮层区域，然后在高倍镜（× 400）下随机观察10 个区域，计数每个区域的上皮层数，取其平均值作为该例患者上皮层数量；（2）观察翼状胬肉和睑裂斑上皮细胞较正常结膜的形态改变；（3）血管数量计数：先在低倍镜（× 100）下观察整个标本的大体轮廓，确定血管密度较高的区域，然后在高倍镜（× 400）下随机观察5 个视野并计数其血管数量，取其平均值作为该视野的血管数量。

1.3 免疫组织化学S-P 法检测将手术切除的组织立即置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，用PBS 冲洗组织3 次，常规置于4%多聚甲醛中固定。标本常规石蜡包埋，以4 μm 连续切片后，按试剂说明进行S-P 法免疫组化染色。其中抗原修复采用高压修复，二氨联苯胺（DAB）显色5 min，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，光镜观察。以PBS 代替一抗孵育，作为阴性对照，以已知有p-ERK、IQGAP1蛋白表达的切片做阳性对照。结果判定：表达的强弱均以免疫组化评分为准。HIS=结合阳性细胞百分比（a）×阳性细胞染色强弱（b）。每张切片在高倍显微镜（× 400）随机选择5 个视野，计算每个视野阳性细胞率，取平均值为该标本的阳性细胞百分比。阳性细胞百分比（a）分4 个等级：无阳性细胞为0 级，阳性细胞占1% ～10%为1 级，占11%～50%为2 级，占51%～80%为3 级，占81%～100%为4 级。阳性细胞染色强弱（b）分4 个等级：阴性为0 级，弱阳性为1 级，中度阳性为2 级，强阳性为3 级。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0 软件进行数据分析。各项测量指标用均数±标准差表示，每一项指标均经过方差齐性检验及正态性检验。样本比较采用完全随机设计的方差分析，所有资料的相关性分析采用Spearman 相关分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE 染色结果

2.1.1 正常结膜组织正常结膜分为上皮层和基质层。上皮层近角膜缘处为复层鳞状上皮，排列整齐；基质层由疏松的结缔组织构成，其间有散在的毛细血管，少量成纤维细胞、淋巴细胞及中性粒细胞（图1A）。

2.1.2 翼状胬肉病理学改变翼状胬肉上皮细胞较正常结膜明显增多。体部上皮细胞呈多边形，大小均匀；而头部上皮细胞明显增加，上皮的基底细胞层可见大量核浆比较大的细胞，排列紧密。基质层主要由胶原纤维、成纤维细胞和大量新生血管构成（图1C）。

2.1.3 睑裂斑病理学改变睑裂斑分为上皮层和基质层。睑裂斑上皮细胞与结膜相比无明显增多，基质层主要为无定型、嗜伊红染色的玻璃样变性或颗粒样变性的胶原物质，其间点缀着断裂、卷曲或碎片状的弹力样纤维（图1B）。

图1 正常结膜、睑裂斑、翼状胬肉的病理切片（HE×600）Fig.1 Pathological section of normal conjunctiva，pinguecula and pterygium（HE×600）

2.1.4 翼状胬肉与睑裂斑的比较（1）上皮层数比较：翼状胬肉上皮层数较睑裂斑及结膜上皮层数增多，差异有统计学意义。（2）血管数量的比较：翼状胬肉血管数量明显多于睑裂斑及结膜血管数量，差异有统计学意义。睑裂斑血管数量较结膜血管数量轻度增加，差异有统计学意义（表1）。

2.2 免疫组织化学结果

2.2.1 p-ERK 的表达情况p-ERK 光镜下主要表达于细胞质中，少数于细胞核中，阳性染色棕黄色或褐色颗粒。p-ERK 在翼状胬肉、睑裂斑、结膜组织中均表达，主要表达在上皮层，基底细胞层表达最强，其中在翼状胬肉中表达最强，睑裂斑次之，结膜最弱。翼状胬肉、睑裂斑组织中p-ERK 表达水平明显高于正常结膜（表2、图2）。

2.2.2 IQGAP1 的表达情况IQGAP1 在翼状胬肉及睑裂斑中表达，主要在上皮层表达，其中基底细胞中表达最强。IQGAP1 在结膜组织中未见阳性表达。IQGAP1 光镜下主要表达于细胞膜和胞浆着色，阳性染色为棕黄色或褐色颗粒。翼状胬肉、睑裂斑组织中IQGAP1 表达水平明显高于正常结膜（表2、图3）。

表1 翼状胬肉、睑裂斑、结膜中上皮层数及血管数量Tab.1 The amount of epithelial layer and blood vessels in pterygium，pinguecula and conjunctiva ±s

表1 翼状胬肉、睑裂斑、结膜中上皮层数及血管数量Tab.1 The amount of epithelial layer and blood vessels in pterygium，pinguecula and conjunctiva ±s

分组结膜睑裂斑翼状胬肉F 值P 值上皮层数4.4±0.699 5.4±1.504c 10±4.137b 13.47＜0.05血管数量5.4±0.894 6.8±0.837c 12.2±1.483b 52.27＜0.05

表2 结膜、睑裂斑、翼状胬肉中p-ERK 及IQGAP1 的表达量Tab.2 The expression of P-ERK and IQGAP1 in conjunctiva，pinguecula and pterygium ±s

表2 结膜、睑裂斑、翼状胬肉中p-ERK 及IQGAP1 的表达量Tab.2 The expression of P-ERK and IQGAP1 in conjunctiva，pinguecula and pterygium ±s

注：a，睑裂斑与结膜相比，P ＜0.05；b，翼状胬肉与结膜相比，P ＜0.05；C，睑裂斑与翼状胬肉相比，P ＜0.05

分组结膜睑裂斑翼状胬肉F 值P 值p-ERK 免疫组化评分1.8±0.447 9.6±0.548a 10.8±1.643b 111.938＜0.05 IQGAP1 免疫组化评分1.0±0.000 5.0±0.000ac 10.2±1.789b 99.75＜0.05

图2 正常结膜、睑裂斑、翼状胬肉中p-ERK 的表达（SP×600）Fig.2 The expression of p-ERK in normal conjunctiva，pinguecula，and pterygium（SP×600）

图3 正常结膜、睑裂斑、翼状胬肉组织中IQGAP1 的表达（SP×600）Fig.3 The expression of IQGAP1 in normal conjunctiva，pinguecula and pterygium（SP×600）

2.2.3 相关性分析在翼状胬肉中，p-ERK 与IQGAP1 的表达呈正相关（r=0.982，P＜0.05）。

3 讨论

翼状胬肉与睑裂斑均为常见眼表疾病。两者的发病机制尚不明确。两者均为球结膜上的病变，两者在病理组织结构存在相似之处。具体两者发病机制差别的相关研究较少。

本研究发现，翼状胬肉及睑裂斑上皮的基底细胞，均为形态规则，核浆比大的细胞，显示是增殖活跃的细胞。与正常结膜相比，翼状胬肉上皮层数与睑裂斑上皮层数增加。翼状胬肉与睑裂斑相比，上皮层数明显增加。说明翼状胬肉上皮细胞的增殖较睑裂斑活跃，睑裂斑上皮细胞也存在增殖潜能。既往的研究显示翼状胬肉与睑裂斑上皮均存在增殖潜能，翼状胬肉上皮增殖能力较强［3-4］。与本研究的结果一致。本研究同时发现，翼状胬肉基质层中血管数量也较睑裂斑基质层的血管数量明显增加。翼状胬肉上皮的增殖较睑裂斑活跃，基质层血管数量明显增多，是翼状胬肉通常侵犯角膜，而睑裂斑通常原位生长的病理学基础。两者的基质深层均可见大片的胶原变性。翼状胬肉与睑裂斑病理结构有一定的相似性，提示两者存在部分相同的发病机制。

ERK 是MAPK 家族成员之一，属于丝氨酸/苏氨残基的蛋白激酶，是细胞信号传导的重要途径。ERK 磷酸化后即p-ERK，进入细胞核调节相关基因的转录，参与细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理过程［5］。本研究发现，与结膜相比，p-ERK 在翼状胬肉中表达增加。研究显示，翼状胬肉中增殖标志物如Ki-67、PCNA、cyclin D1等表达上调［6］。ERK信号通路与细胞增殖密切相关，在多种细胞中调控细胞增殖活动［7-9］。翼状胬肉上皮细胞及血管内皮中p-ERK 表达，提示上皮细胞、血管内皮细胞中ERK 信号通路激活，可能跟上皮细胞、血管内皮细胞的增殖活动增加相关。本研究还发现，与结膜相比，p-ERK 在睑裂斑中表达增加。研究显示，睑裂斑上皮具有增殖潜能［3］。笔者推测，与翼状胬肉相似，ERK 信号通路同样参与睑裂斑上皮细胞及血管内皮细胞增殖。可能由于两者均为隆起于眼表的疾病，上皮细胞暴露在空气中，从而引起两者的上皮鳞状化生。提示两者发病机制存在一定的相似性。有可能是疾病发展不同阶段，或者是某个通路的激活的导致疾病的转化。

IQGAP1 是一种GTP 酶活化蛋白，调节多种重要的细胞活动，如细胞骨架结构、细胞间的黏附、细胞迁移和信号转导。对细胞的正常发育和疾病过程都产生重要影响［10-11］。还参与细胞的增殖和侵袭的调控［12-13］。本研究首次发现，IQGAP1 在结膜几乎未见阳性表达，而在翼状胬肉头部上皮全层均呈阳性表达，在基底细胞及邻近基底细胞的上层细胞表达最强；在翼状胬肉体部，IQGAP1 主要表达在基底细胞中。既往的研究表明，IQGAP1参与细胞的增殖的调控，笔者推测IQGAP1 对翼状胬肉细胞增殖有一定的作用。本研究也发现，在睑裂斑组织中也可见阳性表达，与翼状胬肉体部的表达相似。笔者进一步对翼状胬肉与睑裂斑的IQGAP1 的表达量行统计学分析，显示翼状胬肉的IQGAP1 表达量较睑裂斑增加。基底细胞层含有较多的干细胞，高增殖潜能是干细胞的特点之一，在损伤等条件下较其他细胞具有更高的增殖潜能。笔者推测在紫外线等致病因素损伤角膜缘基底细胞，激活基底细胞的IQGAP1，使角膜缘基底细胞较其他细胞有更高增殖潜能，从而导致翼状胬肉与睑裂斑的发生。

本研究显示，翼状胬肉中p-ERK 与IQGAP1 的表达量具有正相关性。多项研究表明，ERK 信号通路的激活依赖IQGAP1 的活化［14-17］。笔者推测，IQGAP1 在紫外线等致病因素的作用下活化，激活了ERK 信号通路，使细胞异常分化与增殖。而这一作用主要体现在翼状胬肉上皮细胞的基底细胞中。同时也可能在睑裂斑的发病过程中发挥重要作用。

综上所述，在翼状胬肉及睑裂斑中，ERK 信号通路激活可能依赖IQGAP1 的活化参与两者的发病过程，提示两者发病机制有一定的相似之处。由于样本量不足，笔者计划在增加样本量的前提下，对翼状胬肉及睑裂斑中p-ERK、IQGAP1 表达进一步作定量研究。以期找到新的治疗翼状胬肉和睑裂斑的靶点。