丙泊酚预处理对大鼠肝移植术后急性肾损伤的影响

2019-05-24 00:53孟凡兵刘悦沈宁罗刚健
实用医学杂志 2019年9期
关键词:脂肪乳肝移植丙泊酚

孟凡兵 刘悦 沈宁 罗刚健

中山大学附属第三医院麻醉手术中心(广州510630)

肝移植是目前治疗终末期肝病最为有效的手段,随着肝移植技术的提高和手术方式的成熟,各种术后并发症的防治已经成为肝移植研究领域关注的主要问题[1]。在众多器官并发症中,急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是肝移植围术期最为常见且严重的并发症[2]。肝移植过程中门脉阻断导致的低血压引起肾低灌注,门脉和腔静脉开发又引起肾血流再灌注,缺血再灌注这一过程在肝移植术后AKI 的发生发展中有重要的作用[3]。研究[4]表明,丙泊酚对缺血再灌注引起的损伤有保护作用。同时,笔者的前期研究表明,细胞凋亡在小鼠肾缺血再灌注损伤中有重要的作用[5],而且,沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)在肾脏组织的高表达有利于抑制细胞凋亡[6]。而在肝移植引起的术后AKI 中是否有细胞凋亡的参与尚不十分清楚。本研究在大鼠自体原位肝移植(AOLT)模型上探究丙泊酚预处理对肝移植术后AKI 的影响及其可能涉及的机制,旨在为肝移植术后并发症的防治提供新的分子靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组8 周龄的SD 大鼠40 只,体质量(220 ± 20)g,由广东省实验动物中心提供。将40 只大鼠随机分为4 组:假手术组、肝移植模型组、脂肪乳干预组(构建肝移植模型前给予脂肪乳预处理)、丙泊酚干预组(构建肝移植模型前给予丙泊酚预处理),每组10 只。对肝移植模型组大鼠进行AOLT 模型的构建,假手术组只开腹和游离相应血管,对脂肪乳干预组和丙泊酚干预组大鼠建模前连续3 d 每天分别腹腔注射50 mg/kg 脂肪乳和丙泊酚,直至建模当天[7]。

1.2 实验试剂与仪器主要试剂:血尿素氮(BUN)与血肌酐(Scr)检测试剂盒(美国Beckman 公司)、dUTP 缺口末端标记(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(美国Roche Applied Science 公司)、蛋白提取试剂盒(南京KeyGEN BioTECH 公司)、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)、SIRT1 抗体(美国CST 公司)、caspase3 抗体(美国CST 公司)、actin 抗体(美国CST 公司),anti-rabbit-HRP(美国CST 公司)、ECL 发光液(美国Tanon 公司)。主要仪器:CX4型全自动生化分析仪(美国Beckman公司)、多功能酶标仪ELx800NB(美国Bio-TEK 公司)。

1.3 动物模型建立复制大鼠AOLT 模型[7-8]:大鼠术前常规禁食8 h;使用自制麻醉盒行七氟醚半开放吸入麻醉。手术体位取仰卧位,腹部备皮、消毒后腹部正中切口,暴露腹腔。模型组打开腹腔后先剪断左三角韧带及肝圆韧带,分离并结扎左膈静脉;然后,打开右侧后腹膜,分离出肝上下腔静脉;游离、结扎右肾上腺静脉;游离肝下下腔静脉并过线,向上翻转肝脏,暴露第一肝门,游离门静脉至肝门部,过线,并一同游离邻近的肝动脉和胆管。使用肝素盐水(25 U/mL)1 mL 行全身肝素化,然后在肠系膜上静脉、肝动脉及脾静脉血管汇合处上微血管夹阻断门静脉,用4 号针头刺入门静脉,推少量肝素盐水,使肝内血液进入到体循环中。用微血管夹阻断门静脉、肝上下腔静脉和肝下下腔静脉,经门静脉缓慢持续灌注含肝素的醋酸林格液(12.5 U/mL)共30 mL,在肝下下腔静脉壁剪开约1 mm 作为灌注液流出道,当肝脏颜色变为土黄色表示灌注成功,持续灌注约20 min,手术过程中注意加温以维持大鼠体温。灌注完成后拔出针头,缝合穿刺点和流出道,然后,松开微血管夹恢复血流灌注,最后关腹。假手术组在麻醉后按相同步骤进行开腹和游离血管,但不进行肝脏的阻断和再灌注。模型组在肝脏恢复灌注后8h 在深度麻醉下处死大鼠取材。

1.4 肾组织病理学检查取大鼠相同部位肾组织立即于4%多聚甲醛溶液中固定24 h,石蜡包埋、切片,用苏木素-伊红(HE)对切片进行染色。在400 倍光学显微镜下,等间距随机选取10 个视野进行拍摄。

1.5 肾功能指标的检测于大鼠腹主动脉取血5 mL,将血液标本注入含有促凝剂和分离胶的试管中,37 ℃、3 000 r/min 离心15 min,取上清液,采用全自动生化分析仪测定Scr、BUN 水平。

1.6 肾组织细胞凋亡的检测石蜡切片脱蜡、滴加蛋白K 工作液(15 μg/mL)孵育30 min,加50 μL TUNEL 反应混合液,37 ℃避光孵育1 h。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3 次,加DAPI 孵育3 min,于400倍荧光显微镜下观察肾组织细胞凋亡情况并等间距随机选取10 个视野进行拍摄。

1.7 肾组织SIRT1 和caspase3 蛋白表达量的检测用蛋白提取试剂盒提取大鼠肾组织蛋白,BCA 法定量,SDS-PAGE 电泳分离,转膜(湿转,100 V,100 min),5% 脱脂牛奶室温封闭1.5 h;加入一抗(anti-SIRT1 1∶1 000、anti-caspase3 1∶1 000、anti-actin 1∶2 000)4 ℃孵育过夜;PBST 洗涤3 次,每次5 min;加入二抗(anti-rabbit 1∶5 000)室温孵育1.5 h,PBST 洗涤3 次,每次5 min;置于ECL 中1 min,使用胶片曝光。

1.8 统计学方法采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。计量资料结果采用均数±标准差表示,组间比较采用ANOVA 单因素方差分析。以P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾组织病理学变化术后8 h 假手术组大鼠肾组织未见明显的病理改变;肝移植模型组大鼠肾组织出现严重的病理损伤;与AOLT 模型组相比,脂肪乳干预组大鼠肾组织病理损伤差异无统计学意义,而丙泊酚干预组大鼠肾组织病理损伤显著减少(图1)。

2.2 肾功能变化与假手术组相比,模型组大鼠术后8 h 血BUN 和Cr 的水平显著升高;与模型组相比,脂肪乳干预组大鼠血BUN 和Cr 的水平差异无统计学意义,而丙泊酚干预组大鼠血BUN 和Cr的水平显著降低(P <0.05,图2)。

图1 肾组织HE 染色(×400)Fig.1 Kidney tissue HE staining

图2 BUN 和Cr 水平的变化Fig.2 Changes of BUN and Cr level

2.3 肾组织凋亡情况与假手术组相比,模型组大鼠肾组织细胞凋亡显著升高(P <0.05,图3、4);与模型组相比,脂肪乳干预组大鼠肾组织细胞凋亡差异无统计学意义,而丙泊酚干预组大鼠肾组织细胞凋亡显著降低(P <0.05,图3、4)。

2.4 肾组织SIRT1 和凋亡相关蛋白caspase3 表达量的变化与假手术组相比,模型组大鼠肾组织caspase3的表达量显著升高;与模型组相比,脂肪乳干预组大鼠肾组织caspase3的表达量差异无统计学意义,而丙泊酚干预组大鼠肾组caspase3 的表达显著降低(P <0.05,图5)。而肾组织SIRT1的表达量在模型组显著升高,脂肪乳对SIRT1 的表达无显著影响,丙泊酚可进一步上调SIRT1在肾脏组织的表达。

图3 肾组织凋亡染色图片(TUNEL,×400)Fig.3 Apoptotic staining images of renal tissue

图4 肾组织细胞凋亡率的变化Fig.4 Changes of cell apoptotic rate of kidney tissue

图5 SIRT1 和caspase3 蛋白表达的变化Fig.5 Changes of protein expression of SIRT1 and caspase3

3 讨论

AKI 是肝移植术后最为常见和严重的并发症,对患者的生命安全和预后造成巨大的威胁[2]。肝移植手术过程中缺血再灌注这一过程可能对急性肾损伤的发生和发展有重要的作用[3]。大量的研究结果表明,丙泊酚作为最为常用和有效的静脉麻醉药,对缺血再灌注引起的损伤具有保护作用[9-10]。而SIRT1 作为一种去乙酰化酶,可以降低p53 和Foxo3的乙酰化水平,抑制它们的促凋亡作用[11-12]。

本研究通过建立大鼠原位肝移植模型并用丙泊酚预处理来探究其在肝移植术后AKI 中的作用及其可能涉及的机制。丙泊酚预处理能减轻肝移植术后大鼠肾脏组织病理损伤和肾功能损伤[5],但细胞凋亡在其中的作用尚不明确。本研究发现在经历了肝移植的打击后,大鼠肾组织SIRT1 和凋亡相关蛋白caspase3 表达量升高,给予丙泊酚预处理的大鼠在经历肝移植打击后SIRT1 表达量升高的更加显著,而caspase3 表达量有所降低。有研究表明,肾脏在经历缺血再灌注后,SIRT1 会呈现出诱导性表达上调,发挥保护作用,以抵御这一病理生理过程给机体带来的损伤[12]。这提示丙泊酚可能通过进一步上调SIRT1 的表达来抑制细胞凋亡,从而减轻肾组织的损伤。

综上所述,本研究结果表明,细胞凋亡在肝移植术后急性肾损伤中起重要作用,而丙泊酚预处理能进一步上调肾组织SIRT1 的表达,抑制细胞凋亡,从而减轻肝移植术后大鼠的急性肾损伤。这一发现提示,可以通过抑制细胞凋亡来防治肝移植术后急性肾损伤。然而,本研究只是初步探讨了肝移植术后AKI 的分子机制,具体的更深入的机制研究还有待进一步完善。为了进一步证实SIRT1 在丙泊酚预处理中的作用,后续研究可以使用SIRT1 的抑制剂或利用基因敲除来加以验证。

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