XPNPEP2 在胃癌组织中的表达及其临床意义

王伟 周颖 蒋桂英 魏睿 陈曦 奚玲 李飞

华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心（武汉430030）

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一。尽管近年来在手术和其他治疗方面取得了显著的成就，但胃癌患者的5年生存率仍然很低［1］。因此，进一步研究胃癌的分子机制从而为胃癌提供更加合理的治疗方案十分紧迫。XPNPEP2（aminopeptidase P2，氨基肽酶P2 或APP2）是由位于Xq 25 染色体上的人XPNPEP2 基因编码［3］的一种膜结合金属蛋白酶，可催化去除氨基酸序列中脯氨酸N 端P1 位点的氨基酸残基［2］。胶原蛋白、激素、生长因子和细胞因子等生物活性肽的N 末端都含有xaa-Pro 序 列，因 此 是XPNPEP2 的 潜 在 底 物［3］。XPNPEP2 参与调节血管扩张剂缓激肽的代谢，目前其研究主要集中在心血管疾病方面，研究发现XPNPEP2 可能影响ACEI 药物引起的血管性水肿副作用的发生率［4］。且XPNPEP2 基因是女性卵巢早衰的标记基因之一［5］，近年来亦有报道XPNPEP2 可影响卵泡的发育成熟［6］。本课题组在前期研究中发现XPNPEP2 为恶性肿瘤转移的分子标志，在宫颈癌中高表达并可促进宫颈癌转移［7］。笔者在Kaplan-Meier Plotter 在线数据库中亦发现胃癌患者中XPNPEP2 mRNA 高表达可能预示着较低存活率。因此思考XPNPEP2 的改变是否可提示胃癌的发生与发展，然而，尚未有学者就XPNPEP2 在胃癌中的表达及作用进行报道。故本研究基于组织芯片技术，运用免疫组织化学方法检测XPNPEP2 蛋白在72 例胃癌组织及与之部分配对的60 例癌旁组织中的表达情况，并分析其与胃癌临床病理参数及预后的相关性，希望能为胃癌的诊断及预后提供新的分子标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料附有相关临床病理信息及术后随访资料的孔径1.5 mm的胃癌组织芯片1张。组织芯片标本来源于华中科技大学附属同济医院2006年7月至2007年4月期间行胃癌根治术的患者72 例。标本均经病理确诊为胃癌，其临床分期根据美国癌症分期委员会制定的胃癌TNM 分期标准，取60 例癌旁组织。72 例胃癌患者中有40 例患者脉管浸润病理诊断不明确，故未纳入统计。标本经4%甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋。本次标本使用经伦理委员会批准。本组病例性别、年龄、肿瘤大小、脉管浸润、临床分期等见表1。

表1 XPNPEP2 在胃癌中的表达与临床病理参数之间的关系Tab.1 The relationship between expression of XPNPEP2 and clinicopathological parameters in gastric carcinoma

1.2 主要试剂兔抗人XPNPEP2 多克隆抗体（GTX109995，1∶200），SP 染色试剂盒、DAB 显色试剂盒、苏木素染色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化将组织芯片蜡块以4 μm 连续切片，筛选完整样本切片先做HE 染色，再严格按照免疫组化SP 法试剂盒说明进行操作。切片置于恒温箱中烘烤脱蜡；再置于二甲苯中脱蜡2 次；酒精梯度脱水；抗原修复；阻断过氧化物酶；山羊血清室温封闭；封一抗、封HRP 标记二抗，DAB 显色；苏木精复染；自来水分化；中性树脂封片，显微镜观察。以PBS 代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断采用双盲法由2 名病理科医生对免疫组化结果阅片并评分。XPNPEP2 阳性结果为细胞出现棕黄色至深褐色。参照文献［8］按阳性着色强度和阳性细胞百分比进行评分，阳性着色强度：0分（阴性），1分（弱阳性，浅黄色），2分（中等阳性，棕黄色），3 分（强阳性，褐色）。阳性细胞百分比：0 分（0%），1 分（1%～25%），2 分（26%～50%），3 分（51%～75%），4分（76%～100%）。免疫染色总分=阳性着色强度×阳性细胞百分比评分。总分范围0 ～12分，0 ～4分为低表达，5 ～12分为高表达。

1.5 随访采取电话随访、患者所在地公安局人口处查询等方式随访，随访截止时间2014年9月，随访时间1 ～90 个月，中位随访时间48 个月。

1.6 统计学方法运用SPSS 17.0 软件进行数据统计分析。计数资料以率（%）表示，组间阳性率比较采用卡方检验，使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率的比较采用Log-rank 检验，预后评估运用Cox 比例风险模型。以P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 XPNPEP2 在胃癌组织及癌旁组织中的表达如图1 所示，XPNPEP2 蛋白阳性表现为细胞内出现棕黄色颗粒。XPNPEP2 蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的高表达率分别为61.11%、43.33%，差异具有统计学意义（χ2=4.153，P=0.042）。

2.2 XPNPEP2 蛋白的表达与胃癌临床病理特征之间的关系XPNPEP2 在胃癌组织中的表达情况与临床各病理参数如年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤浸润程度、脉管浸润和TNM 分期均未见明显统计学相关性（P ＞0.05），见表1。

2.3 XPNPEP2 蛋白表达情况与胃癌患者总生存期及预后的关系72 例胃癌患者中，XPNPEP2 高表达患者44 例，生存率为20.5%；XPNPEP2 低表达患者28 例，生存率为42.9%。高表达组患者平均生存时间为35.3 个月，95%CI：25.77 ～44.91；低表达组患者平均生存时间为55.0 个月，95%CI：42.48 ～67.52（图2），XPNPEP2 蛋白高表达患者与低表达患者总生存率差异具有统计学意义（χ2= 5.44，P = 0.02）。且在Kaplan-Meier Plotter 数据库中876 例胃癌患者的资料亦发现XPNPEP2 高表达者的总生存期明显短于低表达者（P ＜0.01），见图3。

图1 XPNPEP 在胃癌组织和癌旁正常组织中的表达（免疫组织化学染色×200，×400）Fig.1 Expression of XPNPEP in gastric carcinoma and adjacent normal tissues

图2 XPNPEP2 高低表达组总生存期比较Fig.2 Comparison of over all survival between high and low XPNPEP2 expression levels

图3 Kaplan-Meier Plotter 数据库中XPNPEP2 mRNA 表达水平对胃癌预后的影响Fig.3 The prognostic of the XPNPEP2 mRNA level in gastric cancer was got from Kaplan-Meier Plotter

单因素COX 分析显示：胃癌患者的预后与XPNPEP2 表达水平（χ2= 5.09，P = 0.024）、脉管浸润（χ2= 19.25，P ＜0.001）、TMN 分期（χ2= 7.39，P = 0.007）紧密相关，XPNPEP2 高表达、脉管发生浸润、TMN 分期Ⅲ+Ⅳ期患者预后明显更差（表2）；将单因素分析中差异具有统计学意义的指标纳入多因素Cox 分析示，脉管浸润是影响胃癌预后的独立因素（χ2=16.69，P ＜0.001）（表3）。

表2 单因素COX 生存分析Tab.2 Univariate cox survival analysis

表3 多因素COX 生存分析Tab.3 Multivariate cox survival analysis

3 讨论

中国胃癌发病例数和死亡例数分别占全球胃癌发病和死亡的42.6%和45.0%，在全球183 个国家中发病率位于第5 位，病死率位于第6 位［9］。然而胃癌的发病原因尚未完全明了。

前期研究发现氨基肽酶M 与皮肤癌发生发展密切相关［13］，XPNPEP2 可通过snail 介导上皮间质转化（EMT）的发生从而促进宫颈癌的侵袭与转移［7］，但目前尚未见XPNPEP2 在其他肿瘤中的报道。在本研究中，笔者用免疫组织化学方法检测和比较72 例胃癌组织及其部分配对的60 例癌旁组织中XPNPEP2 的表达水平。统计分析显示胃癌患者XPNPEP2 蛋白的表达水平明显高于癌旁组织，提示XPNPEP2 在胃癌发生发展中起重要作用。研究［11］表明，EMT 与胃癌侵袭转移密切相关。前期研究发现XPNPEP2 在宫颈癌中促进EMT 诱导宫颈癌的侵袭与转移［7］，胃癌组织中高表达的XPNPEP2 可能亦可通过snail 介导EMT，进而促进胃癌侵袭。细胞增殖凋亡与胃癌发生发展密不可分，肿瘤增殖因子Ki67 在胃癌发展过程中扮演重要角色［12］。在组织芯片阅片过程中，笔者发现XPNPEP2 在癌旁组织近基底层细胞染色较腺上皮明显更深，提示XPNPEP2 可能可促进胃癌细胞增殖，目前尚未有相关文献报道。但是，在胃癌组织中XPNPEP2 的表达水平与临床各病理参数并未见明显相关性，这可能由于本次研究样本较少，尚不能检测出其差异。KM 生存曲线分析胃癌患者中XPNPEP2 蛋白高表达可能预示着较低的存活率，此外，本次研究采用Kaplan-Meier Plotte 在线数据库分析XPNPEP2 在876 例胃癌患者中的表达与OS（总生存率）的相关性，数据库结果与本次研究相符。进一步证明XPNPEP2 在胃癌发生发展中发挥重要作用。然而，为进一步验证XPNPEP2在胃癌中的潜在预后价值，在COX比例风险模中进一步验证时却发现XPNPEP2 并不是胃癌不良预后的独立危险因素。本次研究结果表明胃癌组织中XPNPEP2 蛋白表达水平高于癌旁组织，但不足以显示XPNPEP2蛋白的表达水平对胃癌患者生存期有影响，后期需通过扩大样本量等方法进一步研究。