右美托咪定对早期脓毒症大鼠肺水通道蛋白基因表达及炎症因子的影响

雷贤英 伍长学

西南医科大学附属医院ICU（四川泸州646000）

脓毒症是由细菌或内毒素感染机体激活非特异性免疫反应引起的一种严重疾病。右美托咪定（dexmedetomidine）作为具有代表性的镇静镇痛药物之一，有研究表明其具有显著的抗炎作用和肺保护作用［1］，但其具体肺保护机制仍不明确。本研究通过观察右美托咪定对早期脓毒症大鼠水通道蛋白（aquaporin，AQP）基因表达的影响，以探讨右美托咪定在脓毒症救治中的器官保护作用和机制，以寻找出治疗脓毒症的新方法和途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康25月龄雄性Wistar大鼠40 只（西南医科大学SPF 实验动物中心提供，许可证：SYXK（川）2013-065），体质量200～250 g。均饲养在SPF 级环境中，饲喂全价颗粒料，自由进食和饮水。实验前禁食6 h，自由饮水。

1.2 方法

1.2.1 模型复制和药物处理于2015年3-6月，采用随机数字表法，将40 只大鼠分为5 组（n = 8），分别为对照组（生理盐水组）、脓毒症模型组、右美托咪定低剂量治疗组、右美托咪定中剂量治疗组、右美托咪定高剂量治疗组。采用清醒经大鼠尾静脉穿刺置留置针（22 号留置针）方法行尾静脉保留置管，肝素水封管后丝线固定以备给药。对照组以1 mL/kg 注射0.9% 生理盐水，脓毒症模型组以5 mg/kg 给予脂多糖复制脓毒症大鼠模型（10 min 以上注射完），右美托咪定高/中/低治疗组在5 mg/kg 注射LPS 建模成功后立即静脉泵注负荷剂量右美托咪定（6.5 μg/kg，10 min 泵完），再分别按照4.5、1.5、0.5 μg/（kg·h）持续泵入右美托咪定6 h。

1.2.2 标本采集6 h 后用1%戊巴比妥钠静脉缓慢注射麻醉处死大鼠，无菌条件下取下肺组织，将部分肺组织于-80 ℃冷冻保存备用。

1.3 检测指标

1.3.1 荧光定量PCR 检测AQP1 基因的表达取-80 ℃冷冻保存的大鼠肺组织，于研钵中剪碎后加入足量的液氮进行快速研磨，转移组织粉末至无RNA 酶的EP 管中，加入1 mL Trizol，吹打混匀，室温放置5 min；加入0.2 mL 氯仿，剧烈震荡15 s，室温静置5 min，待自然分层；4 ℃，12 000 r/min 离心15 min，小心吸取上层水相于一新的1.5 mL EP 管中；加入0.5 mL 异丙醇，上下颠倒混匀，于室温静置10 min，于4 ℃下12 000 r/min 离心10 min，于管底部可见胶状沉淀；弃上清，加入75%乙醇1 mL（用0.1% DEPC 配制），上下颠倒混悬洗涤RNA 沉淀；于4 ℃下7 500 r/min 离心6 min，弃去上清，再加入75%乙醇1 mL，重复1 次；超净工作台内自然干燥5～10 min，待RNA 呈半透明状态时，加30 μL 0.1% DEPC 水进行充分溶解。取0.5 μg 总RNA 做模板，按照逆转录试剂盒说明书配制20 μL 反应体系，42 ℃20 min，99 ℃5 min 进行cDNA 合成反应。取SYBR 2×Premix Ex TaqTMII，上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL，cDNA 2 μL，在ABI7500荧光定量PCR 仪中以下参数进行扩增：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40 个循环，读板获得融解曲线。得到每个样品的Ct 值，以空白对照组为对照，以18sRNA 为内参基因（表1），计算每个样品的目的基因的相对表达量2-△△Ct，△△Ct =（待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因平均Ct 值）-（对照组目的基因平均Ct 值-对照组内参基因平均Ct 值），比率待测组/对照组=2-△△Ct。

表1 目的基因引物信息Tab.1 Information of target gene primer

1.3.2 肺组织干湿重（W/D）比值测定取部分肺组织，拭干表面血液后称其质量，即为湿质量；采用真空干燥法，将称重后的肺组织置真空干燥箱内，70 ℃，真空4 mmHg 条件下烘烤22 h 后称干重，计算W/D。

1.3.3 双抗体ELISA 法检测相关细胞因子取大鼠部分肺叶，制备10%的肺组织匀浆，于4 ℃下3 000 r/min离心15 min，迅速取其上清液，按照双抗体夹心ELISA 法试剂盒说明书操作，测定TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量。

1.4 统计学方法所有结果均以均数±标准差表示，所有数据均采用SPSS 13.0 软件包进行统计学处理。不同组间比较采用单因素方差分析。若组间存在显著性差异，进一步用Student-Newman-Keuls 法进行两两比较，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AQP1、AQP5 基因表达比较与对照组比较，脓毒症组AQP1、AQP5 基因表达量显著降低；用中、低剂量右美托咪定干预处理后，AQP1、AQP5基因表达量出现一定程度的升高，但变化不明显（P ＞0.05，表2），在高剂量药物处理组，AQP1、AQP5 基因的表达与脓毒症组比较，出现明显增加（P ＜0.05，表2）。

表2 肺组织中AQP1、AQP5 表达变化Tab.2 Expression of AQP1 and AQP5 in lung tissue ±s，μg/L

表2 肺组织中AQP1、AQP5 表达变化Tab.2 Expression of AQP1 and AQP5 in lung tissue ±s，μg/L

注：与对照组比较，*P ＜0.001，△P ＜0.001；与脓毒症组比较，#P ＜0.001，■P ＜0.001

分组对照组脓毒症组低剂量组中剂量组高剂量组样本量8 8 8 8 8 AQP1 1.072 6±0.491 6 0.119 7±0.034 4*0.253 7±0.012 0 0.295 3±0.004 7 0.966 1±0.171 2#AQP5 1.055 7±0.006 9 0.126 5±0.087 1△0.200 8±0.006 9 0.387 1±0.057 0 1.157 5±0.397 9■

2.2 各组肺W/D 比值比较与脓毒症组比较，中、低剂量治疗组W/D 值无明显差异（P ＞0.05，表3），高治疗剂量组W/D 值显著降低（P ＜0.05，表3）。

表3 各组肺W/D 比值和肺组织病理学评分比较Tab.3 Comparison of lung W/D ratio and pathological score in lung tissue of each group ±s

表3 各组肺W/D 比值和肺组织病理学评分比较Tab.3 Comparison of lung W/D ratio and pathological score in lung tissue of each group ±s

注：与对照组比较，△P = 0.003，*P = 0.043；与脓毒症组比较，#P=0.01

分组对照组脓毒症组低剂量组中剂量组高剂量组样本量8 8 8 8 8肺W/D 值4.66±0.51 5.72±0.52△5.28±0.49 5.30±0.43 4.82±0.54#肺组织病理学评分（分）3.26±1.10 6.61±1.75*5.30±1.87 5.26±1.96 5.04±2.01

2.3 肺组织病理学评分脓毒症组肺组织病理学评分明显高于对照组（P ＜0.05）；各治疗组的评分虽低于脓毒症组，但差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。见表3。

2.4 肺组织TNF-α、IL-1β 和IL-6 浓度比较脓毒症组肺组织TNF-α、IL-1β 和IL-6 浓度在用脂多糖造模后表达升高；将高/中/低剂量各治疗组与脓毒症组进行比较，各治疗组TNF-α 的浓度均出现明显降低（P ＜0.05），各治疗组肺组织中IL-1β 的浓度变化不大（P ＞0.05），IL-6 的浓度在高剂量治疗组降低明显（P ＜0.05，表4）。

3 讨论

右美托咪定是ICU、麻醉科常用的镇静剂之一，临床应用已比较广泛，能够有效缓解患者焦虑、谵妄、疼痛等症状，可以改善舒适度，具有较强的镇静镇痛作用，保证危重患者有创治疗和操作的安全实施［2］，还常用于围术期镇静及预防气管插管反应［3］。右美托咪定是一种新型高选择性α2肾上腺素能受体激动剂（α2AR），其内在活性优于可乐定，对患者意识程度影响较小，主要作用于脑干蓝斑区的α2 受体，抑制交感神经的活性，产生镇静、镇痛等功效，同时还具有止涎、抗寒颤等作用，且能够维持患者正常的免疫反应。有实验证实，α2 受体激动剂能抑制外周单核巨噬细胞等的激活，减少炎症因子的产生。α2 受体也广泛分布于延髓、周围血管及外周重要脏器等部位（包括肺、心脏、大脑等）。近年来，有学者对右美托咪定的脏器保护作用进行了研究，其结果显示对大脑、心脏、肾脏、肝脏、肺等均具有一定的保护作用，但其具体机制目前还不太明确［4-5］。有临床观察［6］显示，右美托咪定能减少老年患者术后谵妄的发生率，能降低谵妄测验（CAM-CR）评分。SHI 等［7］的研究发现，在脂多糖引起的急性肺损伤动物模型中，证实右美托咪定能减少肺组织中TLR4 mRNA表达，抑制肺组织的炎性反应，并且降低肺组织重量-体重比，减轻肺水肿，减少胸膜渗出，从而起到肺保护的作用。对呼吸机所致肺损伤的动物实验中，观察到大剂量右美托咪定组血浆中的炎性因子明显减少，肺组织水肿显著减轻［8］。在脂多糖联合IFN-γ刺激引起肺巨噬细胞活性损伤中，右美托咪定明显降低了NR8383 细胞中iNOS 的表达量，该效应可能是通过α2 肾上腺素受体进行介导的［9］。CHIH 等［10］在观察右美托咪定联合氯胺酮应用于内毒素血症大鼠机械通气致肺损伤引发的肺部炎症反应中，观察到二者联用降低了BALF 小鼠总细胞数以及MIP-2、IL-β的浓度，同时降低了肺部W/D，能有效减轻肺部炎症反应。

表4 肺组织炎症因子检测结果Tab.4 Results of inflammatory factor in lung tissue ±s，ng/L

表4 肺组织炎症因子检测结果Tab.4 Results of inflammatory factor in lung tissue ±s，ng/L

注：与对照组比较，aP ＜0.001，*P=0.003；与脓毒症组比较，bP=0.044，cP=0.035，dP=0.01，eP=0.02

分组对照组脓毒症组低剂量组中剂量组高剂量组IL-6 4.036 0±1.645 5 7.986 6±2.447 1*6.082 3±2.108 8 5.363 7±0.200 0 4.162 6±0.090 5d样本量8888 8 TNF-α 5.035 6±1.694 8 14.845 4±5.767 7a 9.392 7±0.768 7b 9.111 0±0.117 8c 8.396 0±2.565 1e IL-1β 5.531 4±1.739 2 7.656 8±3.289 6 5.209 7±0.218 7 2.836 0±0.144 9 4.981 3±0.727 3

急性肺损伤是脓毒症时ARDS 的早期表现，临床上以急性渗透性肺水肿和进行性缺氧性呼吸衰竭为主要表现。肺水肿是其发病机制的中心环节，随着病情的发展，最终导致肺换气功能障碍、肺内分流增加，机体出现严重缺氧、内环境紊乱以及多器官损害。机体肺泡内肺水的转运有两种途径：一是伴随钠离子的主动转运，二是经过肺泡上皮内的AQP 进行转运［11］。AQP 是一组与水通透性有关的细胞膜转运蛋白，通过水孔蛋白亚基的中心通道实现水分子的跨膜转运，在分子水平上经跨膜转运调节机制调节出入细胞膜的水量，在维持肺泡、肺间质及肺毛细血管间的水平衡中起着重要的作用，尤其对清除肺泡内多余液体起着主导作用［12］。整个肺组织以及呼吸道的微血管内皮细胞中均有AQP1 表达，AQP5 则表达在Ⅰ型肺泡上皮细胞和黏膜下的腺细胞内。这些AQPs 在机体出生时会显著增加，并受生长因子、激素、炎症因子和渗透应力的调节［13］。通过增加肺组织中AQP1 和AQP5 的表达可能会减轻急性肺损伤以及肺出血的发生［14］。

本实验结果显示，用脂多糖造模后的脓毒症组AQP1、AQP5 基因的表达量显著降低（P ＜0.05），与对照组比较，脓毒症组肺组织W/D 比值和病理学评分比较明显升高，肺组织TNF-α、IL-1β和IL-6浓度在用脂多糖造模后表达升高。这种现象在高巨等［15］关于“失血性休克-内毒素”二次打击大鼠肺组织水通道蛋白表达的研究中也得到证实，在脂多糖（LPS）诱导、腺病毒感染、高氧刺激等引发的肺损伤动物模型中，均有AQP1 和AQP5 表达水平的下调，其表达水平与肺水肿和肺损伤的严重程度密切相关。可见，AQP1 和AQP5 在脓毒血症相关的急性肺损伤中可能扮演更重要的角色。一系列的研究表明，炎症因子在脓毒症的发病机制中起着极其关键的作用，参与脓毒症炎症反应的炎症介质主要为TNF-α、IL-1β和IL-6 等，由于炎性细胞因子大量释放，诱导肺组织发生炎性反应，导致肺泡毛细血管通透性增加，肺泡内液体的清除和转运发生障碍，中性粒细胞被激活，活性氧、蛋白酶等生物活性物质以及TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎细胞因子得以释放，毛细血管内皮细胞与肺泡上皮细胞间的紧密连接被破坏，肺泡毛细血管通透性增加。炎症与水肿联系密切，抑制促炎细胞因子的释放，控制炎性反应，能够增加AQP1 和AQP5 的表达及其提高其活性，进而促进肺泡内液体的清除。肿瘤坏死因子等炎症介质能够通过调控基因来改变水通道蛋白的合成速率，调节膜细胞膜上水通道蛋白的含量，使水通道蛋白表达下调［16］。

基于右美托咪定的抗炎和肺保护效应，本研究观察到，高剂量药物处理组AQP1、AQP5 基因的表达与脓毒症组比较，出现明显增加（P ＜0.05）；用中、低剂量右美托咪定干预处理后，AQP1、AQP5基因表达量出现一定程度的表达升高，但变化不明显（P ＞0.05）；高治疗剂量组W/D 值明显降低（P ＜0.05）；各治疗组TNF-α 的浓度均出现明显降低（P ＜0.05），但IL-1β 的浓度变化不大（P ＞0.05），IL-6 的浓度在高剂量治疗组降低明显（P ＜0.05）。高剂量的右美托咪定能抑制外周单核巨噬细胞等的激活，减少TNF-α、IL-6 等炎症因子的产生，这些炎性因子的减少可改善毛细血管内皮细胞膜及肺泡上皮细胞膜上水通道蛋白基因（AQP1、AQP5）的表达，肺泡内液体清除加速。通过抑制炎性反应增加水通道蛋白基因（AQP1、AQP5）的表达，减轻肺泡毛细血管的通透性，改善肺泡内液体的清除速率可能是右美托咪定肺保护的机制所在。

综上所述，高治疗剂量［4.5 μg/（kg·h）］的右美托咪定能促进早期脓毒症大鼠AQP 基因的表达，降低肺组织W/D，减轻肺水肿，抑制炎症因子的释放，缓解肺损伤，具有肺保护的作用。