Caspase-3 基因过表达抑制LN-18 人神经胶质瘤细胞移植瘤生长

葛风 蒋云召 王泳

无锡市第三人民医院神经外科（江苏无锡214000）

神经胶质瘤是目前临床上最常见脑肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半，每年新增约14 万病例，65 岁以上人群发病率明显增高［1］。由于晚期肿瘤浸润性生长，与脑组织间无明显边界，难以做到全部切除，一般都主张综合治疗，患者5年生存期不足20%［2］。针对神经胶质瘤发病率高、复发率高和病死率高的特点，有必要探索新的治疗手段，以延长其生存期和改善患者生存质量。细胞凋亡与神经胶质瘤进展密切相关，如何诱导神经胶质瘤细胞凋亡已成为近年来研究热点。caspase-3 蛋白是促细胞凋亡关键酶，通过调节凋亡信号通路传导，促进细胞凋亡［3］。本研究构建caspase-3 基因过表达慢病毒载体，并转染LN-18 人神经胶质瘤细胞，观察caspase-3 蛋白过表达对LN-18 人神经胶质瘤细胞移植瘤生长作用的影响，为caspase-3 蛋白在神经胶质瘤治疗应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料人LN-18 人神经胶质瘤细胞购自上海榕柏生物技术有限公司；胎牛血清、细胞培养基、青霉素-链霉素、细胞培养耗材和胰蛋白酶均购自美国赛默飞生命科技公司；FITC 标记的TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自上海生物工程有限公司；鼠抗人单克隆caspase-3 抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗鼠IgG 均购自美国Abcom 公司；兔抗鼠β-actin 单克隆抗体购自美国sigma 公司。蛋白电泳仪为美国Bio-Rad 公司产品。上海吉玛基因公司提供caspase-3 基因相关产品和慢病毒载体。

1.2 构建caspase-3 转染慢病毒在线搜索caspase-3 基因信息，设计模板序列基因，上游引物序列：5′-CCCGAATAAGAGAGAACCAAC-3′，下游序列：5′-CATTCCTTATATGTCTCCGTAC-3′，PCR 反应条件：预变性（94 ℃）2 min；变性（94 ℃）45 s，退火（55 ℃）25 s，延伸（72 ℃）35 s，共35 次循环，延伸（72 ℃）6 min，抽提GV128 质粒，利用自失活型慢病毒包装系统，将包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0和caspase-3 基因载体质粒共转染239T 细胞，转染48 h 后，1 000 r/min 高速离心，收集含caspase-3 基因慢病毒颗粒细胞上清液，-80 ℃保存备用。

1.3 体外转染LN-18人神经胶质瘤细胞待细胞融合至90%，0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min 离心收集细胞，细胞重悬后以1 × 105个/mL 接种48 孔板。LN-18 人神经胶质瘤细胞最佳转染复数为150，设置3 组，其中添加5 μg/mL Polybrene 和50 μL caspase-3 基因重组病毒上清液为转染组，添加5 μg/mL Polybrene + 50 μL 阴性对照病毒上清液为对照组和不添加病毒上清液为空白组，37 ℃孵育10 h，更换细胞培养液，继续孵育。

1.4 免疫印迹法检测caspase-3 蛋白表达蛋白裂解液收集蛋白，检测样品总蛋白浓度（BCA 法），高温致蛋白变性，80 V SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并转膜2 h，5%牛血清蛋白封闭1 h，切割薄膜，加入1∶300 鼠抗人单克隆caspase-3 抗体，4 ℃孵育过夜，加入1∶1 000 HRP 标记羊抗鼠二抗室温孵育30 min，1∶1 000稀释β-Actin 作为内参，显色定影，软件分析杂交条带。

1.5 构建LN-18 人神经胶质瘤移植瘤裸鼠模型待LN-18 细胞生长至对数期，胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞，1640 培养基重悬细胞（密度1×108个/mL），将上述细胞悬液注射至裸鼠背部皮下，200 μL/只，细胞数量约2 × 107个，共设转染组、对照组和空白组，每组5 只裸鼠，每3 天记录肿瘤大小情况，比较各分组瘤块体积，瘤块测量用长径（a）×短径（b）表示，单位cm，肿瘤体积=0.5×a×b2，接种21 d 后处死实验动物，取出瘤块，测量对比各组肿瘤体积。

1.6 肿瘤组织内细胞凋亡测定取出各分组肿瘤组织，甲醛固定，石蜡包埋，切片机制备5 μm 蜡块切片，梯度酒精法脱蜡入水，置于0.2%曲拉通溶液破膜10 min，PBS 缓冲液清洗3 遍，加入25 μL TUNEL 细胞凋亡检测液，25 ℃避光孵育60 min，PBS 缓冲液清洗3 遍，荧光显微镜下观察并拍照，利用IPP 软件测定各组荧光积分光密度（integral optical density，IOD），以空白组为对照计算相对IOD 值。

1.7 统计学方法以（± s）表示实验结果，采用单因素多样本方差分析比较多组间均值，采用t 检验比较两组间均值差异，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞转染效率测定慢病毒载体可携带多种荧光标记，体外转染LN-18 人神经胶质瘤细胞72 h，流式细胞仪上样检测细胞转染率达到83.7%（图1 A），倒置显微镜下观察转染LN-18 人神经胶质瘤细胞（图1B），荧光显微镜下观察到满视野绿色荧光分布（图1C），证实其具备后续实验应用的可行性。

2.2 caspase-3蛋白表达转染组、对照组和空白组caspase-3 蛋白相对表达量分别为（1.259 ± 0.238）、（0.181±0.079）和（0.147±0.069），转染组caspase-3蛋白水平显著增加（P ＜0.001），对照组与空白组差异无统计学意义（P ＞0.05，图2）。

图1 体外慢病毒转染LN-18 人神经胶质瘤细胞Fig.1 LN-18 human glioma cells were transfected by lentivirus in vitro

图2 各组Caspase-3 蛋白表达Fig.2 The expression of Caspase-3 protein in each group

2.3 肿瘤生长曲线测定每隔3 d 测量各组肿瘤生长体积，对比各分组肿瘤体积随时间变化情况，至皮下移植21 d，转染组、对照组和空白组瘤块体积分别为（0.52 ± 0.17）、（2.61 ± 0.22）和（2.38 ±0.19）cm3，（F=104.241，P=0.021 89），表明肿瘤生长受到明显抑制（图3）。

2.4 细胞凋亡分析本研究采用FITC 标记凋亡信号，当绿色信号越高时，表明细胞凋亡越明显。移植皮下成瘤21 d 后，转染组、对照组和空白组荧光强度分别为（6 572±1 319）、（908±199）和（875 ± 262），转染组细胞凋亡数目显著高于空白组和对照组，差异具有统计学意义（图4，P ＜0.001）。

图3 肿瘤生长体积测定Fig.3 Tumor growth volume determination

图4 细胞凋亡率测定（×100）Fig.4 The measurement of cell apoptosis

3 讨论

细胞凋亡是细胞自主程序性死亡，其中涉及多种基因的激活、表达以及调控，在肿瘤发生发展过程中起着重要作用［4］。细胞凋亡与肿瘤细胞分化程度、肿瘤组织学分级、淋巴转移程度和肿瘤临床分期均存在显著相关性［5］。诱导肿瘤细胞凋亡被认为是治疗癌症的创新思路。细胞凋亡均伴随着caspase 基因激活和异常表达，caspase-3 蛋白是细胞凋亡信号传导关键环节，活性caspase-3 可降解相应的胞浆胞核底物，诱导细胞凋亡，当caspase-3 活性受到抑制，则出现细胞凋亡异常，从而诱发肿瘤［6］。caspase-3 蛋白在神经胶质瘤组织中高表达，阳性率达到78.85%（41/52），而正常组织caspase-3 蛋白阳性率仅15.38%（2/13）［7］。同时，药物诱导的神经胶质瘤细胞凋亡常常伴随着caspase-3基因激活和caspase-3 蛋白高表达，暗示其为诱导神经胶质瘤细胞死亡过程中的一项重要环节［8］。另外，神经胶质瘤肿瘤分期越高，caspase-3 蛋白阳性表达率越低，这提示caspase-3 蛋白表达水平与神经胶质瘤恶性程度及患者预后呈负相关［9］。基于以上事实，拟利用基因工程技术促caspase-3 蛋白过表达，则有望治疗神经胶质瘤。

慢病毒属是反转录病毒科下的一种分支，可产生更加稳定的体外转染效果，通过细胞表面受体和慢病毒膜糖蛋白相互作用进入宿主细胞，可使其持续表达目的蛋白［10］。脂质体和质粒是目前实验室常用转染剂，其操作方法简单，但两者细胞转染率均较低，生物安全性不高，且存在较明显细胞毒性［11-12］。与之相比，慢病毒转染效率明显升高，且与转染靶细胞类型密切相关，通常可达50%～80%［13］。笔者利用慢病毒转染LN-18 人神经胶质瘤细胞，体外转染实验中，利用流式细胞仪检测GV128 慢病毒载体转染效率高达83.7%，笔者推测这种高转染效率与本研究选用的LN-18 细胞类型密切相关，LN-18 胶质瘤细胞活性强，其慢病毒转染率随之升高。观察caspase-3 基因过表达对于移植瘤生长的影响是本研究的重点和难点。既往有学者采用慢病毒瘤体注射方式，但这种方式存在试剂浪费，注射不均匀，体内转染效率低且无法准确检测等诸多缺陷［14-15］。本研究在体外预先利用caspase-3 基因过表达慢病毒转染LN-18 人神经胶质瘤细胞，随后再皮下注射移植成瘤，则可避免慢病毒瘤体注射缺陷，使实验过程变得更为清晰和可控。体内结果证实，转染组细胞凋亡率明显增加，肿瘤生长体积明显受到抑制。

综上，通过基因重组技术构建caspase-3 基因过表达慢病毒载体，体外转染人LN-18 人神经胶质瘤细胞，可显著促进LN-18 人神经胶质瘤细胞凋亡，明显抑制肿瘤生长，具有良好的神经胶质瘤治疗应用潜力。