结直肠癌患者血清miR-21检测的临床价值

贺 雪,殷佩浩

上海中医药大学附属普陀医院普外科,上海 200062

结直肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一,发病率逐年上升[1]。研究表明,microRNA表达失调是肿瘤普遍特征,可作为检测肿瘤发生发展的标志物[2-4]。miR-21是结直肠癌组织中最常见的过表达microRNA之一[5],以“癌基因”身份参与结直肠癌发展、侵袭、转移等重要过程。本研究通过检测结直肠癌患者手术前后血清miR-21表达变化,并与正常人血清 miR-21水平对比,探讨血清miR-21表达对结肠癌患者的临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象入选标准

按中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会医政司制定的《中国常见恶性肿瘤诊治规范》结直肠癌诊断标准,全部病例均经手术病理确诊。按国际抗癌联盟(UICC)第8版结直肠癌分期标准收集高危Ⅱ～Ⅲ期患者。高危Ⅱ期的高危因素包括肿瘤分化3～4级、淋巴管/血管浸润、肠梗阻、检出淋巴结<12个;或T4N0M0;或T3伴局部穿孔或接近切缘、切缘不确定或切缘阳性;Ⅱ～Ⅲ期结直肠癌TNM分期参照UICC。

纳入标准:(1)年龄为18～80岁,性别不限;(2)经影像及血液检查诊断为可手术结直肠癌;(3)均为结直肠癌根治手术后病例;(4)符合结直肠癌诊断标准,有明确的病理、细胞学诊断结果;(5)TNM分期为高危 Ⅱ、Ⅲ 期;(6)入组时未经过化疗、无明确复发转移;(7)预计生存期>6个月;(8)卡氏(Karnofsky)评分≥70分;(9)无严重心、肝、肾、造血系统疾患,化疗禁忌证及其他影响药物;(10)自愿参加本试验并签署知情同意书。

排除标准:(1)不符合上述入选标准者;(2)已行化、放疗等治疗者;(3)已有腹腔、肝脏的复发转移者;(4)有明显心(冠心病、心肌梗死等严重心脏疾病史)、肝(谷丙转氨酶、谷草转氨酶明显异常)、 肾(慢性肾脏病分期>2 期)等功能损害,或精神病患者、孕妇或哺乳期妇女;(5)过敏体质或对多种药物过敏者。

剔除标准:(1)试验过程中发现不符合病理选择标准者;(2)用药过程中出现严重不良反应如肝肾功能异常等或某些合并症、并发症及不宜继续接受治疗者;(3)用药过程中,因非药物因素而患其他疾病不能继续治疗者;(4)未按规定用药、无法判断疗效,或资料不全等影响疗效或安全性判断者;(5)因其他因素而自行退出试验者。

1.2 临床资料

根据上述纳入标准及排除标准,选取2016年6月至2018年3月上海市普陀区中心医院普外科收治的结直肠癌患者33例;另选取同期本院体检的健康志愿者20例为对照组。均签署知情同意书,愿意配合血标本采集和随访。33例结直肠癌中,男19例,女14例,年龄(65.64±8.89)岁;结肠癌27例,直肠癌6例;低分化8例,中分化25例;高危Ⅱ期15例,Ⅲ期18例。对照组志愿者,男12例,女8例,年龄(63.25±4.08)岁。两组性别、年龄无差异,具可比性。

1.3 实验室检测

1.3.1 血标本采集、处理

分别采集结直肠癌患者手术前后1周和健康志愿者体检当日清晨空腹外周静脉血5 mL。常温下4 h内全血离心(4 ℃、1 200 r/min);离心得血清0.5～1 mL,收集于EP管中,编号后冻存于-80 ℃冰箱中备用。

1.3.2 RT-PCR检测

应用MiRCURY RNA Isolation Kit(丹麦Exiqon公司)提取血清总miRNA,采用反转录试剂盒以RNA为模板进行反转录,得cDNA,以U6为内参,采用RT-PCR仪(ABI7300实时定量PCR仪,美国ABI公司)对miR-21进行扩增,引物序列见表1。miR-21反应体系为:miRNA特异引物(10 μmol/L) 0.5 μL,mRQ 3′引物0.5 μL,SYBR Advantage Premix(2×) 12.5 μL,ROX Dye(50×) 0.5 μL,cDNA 2.0 μL,ddH2O 9 μL,共25 μL。U6反应体系为:U6正向引物(10 μmol/L) 0.5 μL,U6反向引物(10 μmol/L) 0.5 μL,SYBR Advantage Premix(2X) 12.5 μL,ROX Dye(50X) 0.5 μL,cDNA 2.0 μL,ddH2O 9 μL,共25 μL。反应条件:95 ℃ 10 s变性;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s;定量PCR×40个循环;95 ℃ 60 s,55 ℃ 30 s,95 ℃ 30 s解离。实验结果导入Excel表中进行分析和计算,Ct值是反映管内荧光信号到达规定值时所历经的循环数目,ΔCt等于miR-21的Ct值与内参基因U6的Ct值的差值。运用2-ΔCt方法得出miR-21相对表达量。

表1 引物序列

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。定量资料用均数±标准误表示,采用t检验;分类资料用频数(百分比)表示,采用卡方检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肠癌患者和健康志愿者血清miR-21

33例结直肠癌患者术前血清miR-21相对表达量明显高于20例健康志愿者血清miR-21相对表达量(5.05±0.96对0.79±0.14,P<0.05),见表2。

分组例数miR-21t值P值健康者200.79±0.14肠癌335.05±0.964.406<0.001

2.2 肠癌患者手术前后血清miR-21

33例结直肠癌患者术后血清miR-21相对表达量明显低于术前血清miR-21相对表达量(1.38±0.15对5.05±0.96,P=0.001),见表3。

分组例数miR-21t值P值术前335.05±0.96术后331.38±0.153.8040.001

3 讨论

鉴于结直肠癌发病率及死亡率逐年上升,临床发现时多为中晚期,手术和/或术后放化疗后仍有30%～50%患者死于肿瘤复发,因此有必要寻找有效的结直肠癌标志物以助于早期确诊并预测疗效[6]。

MicroRNA作为一种特殊的遗传物质一直受到学术界的重视。它是一类小分子非编码单链RNA,长度约22个核苷酸左右。研究表明,microRNA异常表达或失调是肿瘤组织的普遍特征。miR-21是较早被发现且公认的致癌性microRNA,是实体肿瘤(包括结直肠癌)中最常见的过高表达microRNA之一[7]。文献报道,miR-21在结直肠癌患者组织、血清、粪便样本中均过表达[8-9]。本研究中结直肠癌患者血清miR-21相对表达量显著高于健康志愿者,结果与文献报道一致;且术后结直肠癌患者血清miR-21相对表达水平较术前显著降低。提示,血清miR-21高表达可作为结直肠癌诊断和疗效预测的标志物,有潜在临床价值。基于PCR技术miRNA检测具有操作简单、价格低廉、诊断灵敏等特征,而目前又无结直肠癌miRNA检测试剂盒,我们相信,深入探讨结直肠癌miR-21检测试剂盒具有一定研究前景。

目前,血清miR-21具体来源仍不明了。有学者推测,血清miR-21可能是由肿瘤细胞坏死或凋亡后细胞内miRNA主动释放至血液中所致[10]。手术切除肿瘤后miR-21明显下降可能提示血清miR-21与肿瘤组织分泌相关。