基于UPLC-Q TOF-MS和HPLC-QQQ-MS技术的赤豆酚类化合物定性、定量分析及其抗氧化能力分析

李文婷，顿 倩，李红艳，邓泽元，张 兵*

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

赤豆（Vigna angularis）又名红小豆、红豆，是一种重要的豆科类作物。赤豆含有黄酮、皂苷、植物甾醇、赤豆红色素等生物活性物质[1]，作为药食同源作物，赤豆除供日常食用外，在功能食品和医药领域[2-3]的应用受到越来越多的关注。研究表明，赤豆汁可以降低健康年轻女性的血清三酰甘油浓度[4]，赤豆提取物具有减肥[5]、有效减缓血压升高[6]、抑制血清胆固醇浓度[7]、抑制高血糖[8]等功效，赤豆荚果黄酮提取物对Fe2+导致的大鼠原代肝细胞氧化损伤具有保护作用[9]。

豆类植物较高的抗氧化活性与其丰富的多酚、黄酮及花色苷等物质含量密切相关[10-12]。已有研究表明[13-15]，存在于植物中的天然抗氧化剂如多酚、生育酚、类胡萝卜素等植物化学物，可以起到保持人体健康、预防慢性疾病的作用。植物体中的天然多酚类物质主要包括酚酸、黄酮和单宁类物质[16]。存在于植物中的酚类物质主要包括有机溶剂可直接提取的可溶性酚类和有机溶剂不可直接提取的结合态酚类。可溶性酚类提取物中除游离形态存在以外，还可通过酯键、醚键、糖苷键的形式与其他物质结合[17]。将有机溶剂提取后的上清液经过碱、酸水解处理，并进行萃取，可从有机溶剂提取液中分别提取出游离态酚类、酯键合态酚类、糖苷键合态酚类。有研究[16,18-19]对红枣中酚类物质进行研究，分别提取出游离态、酯键合态、糖苷键合态和碱解结合态酚类。

至今，对于赤豆中不同键合形态酚类物质（游离态、酯键合态、糖苷键合态）的含量及其抗氧化活性方面，鲜见相关研究报道。因此，基于前人对酚类物质及赤豆植物化学物的相关研究，本研究的主要目的是评价赤豆中游离态、酯键合态、糖苷键合态酚类物质含量，并进行体外抗氧化活性研究，采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q TOF-MS）和高效液相色谱串联三重四极杆质谱（high performance liquid chromatography coupled with triple quadruple mass spectrometry，HPLCQQQ-MS）联用技术对赤豆80%甲醇溶液提取物中酚类物质进行定性、定量分析，以更好地了解赤豆的营养保健作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤豆，2015年12月购于南昌当地超市。

没食子酸、儿茶素、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、对香豆酸、木犀草素、金丝桃苷、芦丁、黄豆苷元、黄豆黄素、槲皮素、奎诺二甲基丙烯酸酯（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carbox，Trolox）、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tripyridine triazine，TPTZ）、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 上海阿拉丁试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 成都西亚化工股份有限公司；福林-酚试剂 上海荔达生物科技有限公司；无水甲醇、FeCl3·6H2O、乙酸乙酯、盐酸、硫酸、冰醋酸、K2S2O8、三水醋酸钠、NaOH、Na2CO3、NaNO2、FeSO4西陇科学股份有限公司；乙醚 国药集团化学试剂有限公司；AlCl3天津恒兴化学试剂制造有限公司。

1.2 仪器与设备

HY-2调速多用振荡器、N-1100旋转蒸发仪 上海比朗仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 常州市华普达教学仪器有限公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；AL104电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；TDL-5-A离心机 上海安亭科学仪器厂；酶标仪 美国伯腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酚类物质提取及测定

准确称取1.00 g研磨好的赤豆粉末于50 mL离心管中，按1∶15（g/mL）料液比加入15 mL 80%甲醇溶液，室温条件下超声提取1 h，4 200×g离心10 min后收集上清液，重复提取4 次，合并甲醇提取液用于游离态、酯键合态和糖苷键合态酚类物质分析，样品于-20 ℃冰箱贮藏备用。

1.3.1.1 不同键合态提取液的制备

不同键合态提取液的制备参考文献[16,18-19]方法，具体提取方法如下：

游离态酚类的制备：将赤豆80%甲醇提取液于35 ℃旋转蒸发至20 mL，用6 mol/L HCl溶液调pH 2，该部分酚类物质通过加入等体积有机溶剂（体积比1∶1的乙醚-乙酸乙酯混合溶液）进行萃取，重复萃取5 次。将萃取分离的有机相合并，35 ℃旋转蒸发至干后，复溶于5 mL 80%甲醇溶液中，即为游离态酚类提取物，样品于-20 ℃冰箱贮藏备用。

酯键合态酚类的制备：向上述提取过游离态酚类的水相中加入10 mL 4 mol/L NaOH溶液，同时充入氮气，室温条件下摇床振荡反应4 h后，用6 mol/L HCl溶液调pH 2，该部分酚类物质萃取过程同上。

糖苷键合态酚类的制备：向上述提取完酯键合态酚类的水相中再加入4 mL HCl溶液，85 ℃水解反应30 min，该部分酚类物质萃取过程同上。

1.3.1.2 酚酸含量的测定

酚酸含量测定采用福林-酚法[20-21]，以没食子酸为标准品，选用96 孔板进行测定。取25 μL样品或标准品溶液和125 μL 0.2 mol/L福林-酚试剂于室温反应10 min后，加125 μL 10 g/100 mL饱和Na2CO3溶液，在振荡器上缓慢摇匀后室温条件下放置反应30 min，在765 nm波长处测定吸光度。由没食子酸系列标准溶液制作标准曲线，以干质量计算样品酚酸含量，结果表示为mg/g。

1.3.1.3 黄酮含量的测定

黄酮的测定采用亚硝酸钠-三氯化铝法[20-21]，以儿茶素为标准品，选用96 孔板进行测定。取25 μL样品或标准品溶液与110 μL 0.066 mol/L NaNO2溶液室温混合反应5 min后，加入15 μL的0.75 mol/L AlCl3溶液反应6 min，最后加入100 μL 0.5 mol/L NaOH溶液，在振荡器上缓慢摇匀室温反应10 min后在510 nm波长测定吸光度。由儿茶素系列标准质量浓度制作标准曲线，以干质量计算样品黄酮含量，结果表示为mg/g。

1.3.1.4 亚铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）测定

FRAP测定采用文献[20-21]测定方法进行，具体测定步骤如下：

实验试剂的配制：40 mmol/L盐酸溶液：取12 mol/L浓盐酸 0.1 mL加水至30 mL；20 mmol/L三氯化铁溶液：称取0.270 3 g的FeCl3·6H2O，用超纯水定容至50 mL；0.3 mol/L醋酸钠缓冲溶液：称取三水醋酸钠0.31 g，加冰醋酸1.6 mL，然后再用超纯水稀释定容至100 mL；10 mmol/L TPTZ溶液：称取TPTZ样品31.233 mg，用40 mmol/L盐酸定容至10 mL，置于4 ℃冰箱中保存；FRAP工作液：醋酸钠缓冲溶液，三氯化铁溶液和TPTZ溶液按10∶1∶1的体积进行混合，制得质量浓度为0.04 mg/mL的工作液，现用现配。

测定方法：加10 μL样品或FeSO4标品溶液和180 μL预热至37 ℃的FRAP工作液至96 孔板，在振荡器上避光摇匀37 ℃反应10 min，于593 nm波长处测定其吸光度。以FeSO4系列标准溶液制作标准曲线，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4物质的量（mmol/g）表示。

1.3.1.5 DPPH自由基清除能力测定

DPPH自由基清除能力测定采用文献[20-21]方法进行，具体测定步骤如下：

加100 μL 0.065 mmol/L DPPH-甲醇溶液与100 μL样品或空白溶液于96 孔板中，避光条件下在振荡器上缓慢摇匀后室温条件下反应30 min，使用酶标仪在517 nm波长测定其吸光度。建立Trolox含量与DPPH自由基清除率的标准曲线，样品DPPH自由基清除能力以达到同样消除率所需的Trolox质量（mg/g）计，DPPH自由基清除率计算见式（1）：

式中：Ai为样品溶液加DPPH试剂混合液的吸光度；Aj为样品溶液加80%甲醇的吸光度；Ac为DPPH溶液加样品溶剂的吸光度。

1.3.1.6 ABTS阳离子自由基清除能力测定

ABTS阳离子自由基清除能力测定根据文献[20,22]的方法进行，具体测定步骤如下：

实验试剂的配制：将5 mL 7.0 mmol/L ABTS储备液与88 µL 140 mmol/L K2S2O8混匀，静置12～16 h，配制成ABTS工作液。ABTS工作液用80%甲醇溶液稀释，使混合溶液在734 nm波长处吸光度为0.7±0.02。

测定方法：200 μL ABTS溶液和20 μL样品或标品溶液分别加入96 孔板中，避光条件下在振荡器上缓慢摇匀室温反应6 min，在734 nm波长测定吸光度，建立Trolox含量与自由基清除率的标准曲线，样品ABTS阳离子自由基清除能力以达到同样消除率所需Trolox质量（mg/g）表示，ABTS阳离子自由基清除率计算见公式（2）：

式中：A0为ABTS溶液和样品溶剂混合液的吸光度；Ai为ABTS溶液和样品溶液混合液的吸光度；Aj为80%甲醇溶液和样品溶液的吸光度。

1.3.2 UPLC-Q TOF-MS定性分析

定性分析参考Peng Han等[23]条件，并适当调整，具体实验条件如下：

UPLC条件：色谱分离采用UPLC系统（Agilent 1290 infinity series），包含脱气机、二元泵（Bin Pump SL）、进样器（HiP-ALS）、柱温箱（TCC SL）、二极管阵列检测器。使用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。流动相：含0.1%甲酸溶液（A）和甲醇溶液（B），梯度洗脱程序：0～10 min，5%～10% B；10～30 min，10%～30% B；30～38 min，30%～50% B；38～43 min，50% B；43～45 min，50%～5% B。进样量5 μL，柱温35 ℃，流速0.3 mL/min，检测波长280 nm。

MS条件：采用飞行时间质谱仪（Agilent 6538 Q TOF），电子电离源，采用全扫描负离子模式扫描。全质谱数据在m/z 50～1 000质量范围下获得，最佳质谱参数：毛细管电压3.5 kV；雾化气压力30 psi；干燥气流速10.0 L/min；干燥气温度300 ℃；裂解电压175 V；母离子MS2碰撞能10～40 V。

1.3.3 HPLC-QQQ-MS定量分析

定量分析参考Peng Han等[23]条件进行，并适当调整，具体实验条件如下：

HPLC条件：色谱分离采用HPLC系统（Agilent 1260 infinity series），包含脱气机、二元泵（Bin Pump SL）、进样器（HiP-ALS）、柱温箱（TCC SL）、二极管阵列检测器。使用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。流动相：0.1%甲酸溶液（A）和甲醇溶液（B），梯度洗脱程序：0～18 min，5%～50% B；18～25 min，50%～95% B；25～28 min，95%～5% B。进样量5 μL，柱温35 ℃，流速0.3 mL/min。

MS条件：采用三重四极杆质谱仪（Agilent 6430 QQQ），电子电离源，采用质谱多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）负离子模式用于定量分析。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 酚酸、黄酮含量及抗氧化能力分析

由表1可知，80%甲醇溶液提取物中酚酸含量为3.44 mg/g，黄酮含量为2.50 mg/g。80%甲醇溶液提取物中以不同键存在的酚酸、黄酮含量不同，其中糖苷键合态酚酸含量最高，可达1.44 mg/g，游离酚类物质黄酮含量最高，可达0.85 mg/g，而以酯键合态形式存在的酚类物质酚酸、黄酮含量最低，分别为1.06 mg/g和0.17 mg/g。李思荻等[24]测定出红小豆提取物中酚酸含量为1.403 9～2.754 8 mg/g，低于本实验研究结果；而Gan Renyou等[25]研究表明，总酚、总黄酮含量分别为13.37 mg/g和9.41 mg/g；Sreerama等[26]所测赤豆提取物中总酚、黄酮含量分别为4.89～8.78 mg/g和5.06～5.81 mg/g，均高于本实验结果，这可能是由实验所用原料品种、区域、提取方法及测定方法差异导致。

表 1 赤豆提取物的酚类含量及其抗氧化能力测定Table 1 Total phenolic content and antioxidant activity of adzuki bean extract

如表1所示，80%甲醇溶液提取物中FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力分别为42.04 mmol/g、5.46 mg/g、14.92 mg/g。80%甲醇溶液提取物中不同存在形式酚类提取物的抗氧化能力不同，其中FRAP为糖苷键合态＞游离态＞酯键合态；酯键合态提取物DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力均为最强，而糖苷键合态最弱，酯键合态酚类物质DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力分别为1.54、3.50 mg/g，糖苷键合态酚类物质DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力分别为0.79、1.21 mg/g。Gan Renyou等[25]研究表明，赤豆提取物FRAP、ABTS阳离子自由基清除能力分别为139 mmol/g、95.3 mmol/g，高于本研究结果；Sreerama等[26]所测赤豆提取物FRAP、DPPH自由基清除能力分别为27.39～34.36 mmol/100 g、4.44～5.70 μmol/g，低于本研究结果，可能是由于原料栽培品种及提取物中所含的酚类物质种类及含量不同。

2.2 UPLC-Q TOF-MS定性分析

采用UPLC-Q TOF-MS对80%甲醇溶液提取物中酚类物质进行鉴定，根据化合物的保留时间、紫外吸收光谱、质谱测定的分子离子峰和碎片离子峰数据、标准品的保留时间等信息，结合参考文献和数据库（Metlin）对其结构进行初步鉴定。其总离子流色谱如图1所示、280 nm波长色谱如图2所示。鉴定结果见表2，初步鉴定出25 种化合物，包括3 种有机酸、6 种酚酸和16 种黄酮。王海棠等[1]通过化学检识、纸色谱、薄层色谱和紫外、红外、核磁共振、质谱等技术鉴定出赤豆提取物中含有芦丁；Amarowicz等[35]从赤豆粗提物中鉴定出原儿茶酸、对香豆素、槲皮素、儿茶素、表儿茶素衍生物、杨梅素糖苷、山奈酚糖苷、原花青素等物质；Takahama等[36]从赤豆提取物中鉴定出儿茶素、表儿茶素、花旗松素、芦丁、槲皮素；Bai Yan等[37]从赤豆提取物中鉴定出异槲皮素、芦丁、绿原酸、异木犀草素己糖苷。本实验在赤豆80%甲醇溶液提取物中新鉴定出对羟基苯甲酸、茵芋苷、金丝桃苷、黄豆苷元、黄豆黄素、芹菜素衍生物6 种酚类物质。

图 1 80%甲醇溶液提取物负离子模式下总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatogram of 80% methanol extract in negative ion mode

图 2 80%甲醇溶液提取物负离子模式下280 nm波长色谱图Fig. 2 DAD chromatogram at 280 nm of 80% methanol extract in negative ion mode

表 2 赤豆80%甲醇溶液提取物中酚类化合物鉴定Table 2 Characterization of phenolic compositions of 80%methanol extract

续表2

2.3 HPLC-QQQ-MS定量分析

表 3 酚类化合物负离子模式下的定量条件及其在80%甲醇溶液提取物中的含量Table 3 Quantitative analysis conditions for phenolics in negative ion mode and their contents in 80% methanol extract

对所鉴定成分中11 种酚类物质进行定量分析，由表3可以看到，赤豆80%甲醇溶液提取物中芦丁、儿茶素类物质含量最高，分别为327.40 μg/g和210.70 μg/g，其次为原儿茶酸、对香豆酸，黄豆苷元、槲皮素、金丝桃苷、绿原酸，而对羟基苯甲酸、木犀草素、黄豆黄素含量最低，分别为0.52、0.16 μg/g和0.09 μg/g。Amarowicz等[35]对赤豆提取物进行定量分析，测得原儿茶酸、对香豆素、槲皮素、儿茶素、杨梅素糖苷、山奈酚糖苷含量分别为67.6、31.3、36.2、688.0、212.0 μg/g和38.2 μg/g；Gan Renyou等[25]对赤豆皮提取物进行定量分析得到赤豆皮芦丁含量为（0.42±0.02）mg/g；Bai Yan等[37]对赤豆提取物进行定量分析，测得异槲皮素、芦丁、绿原酸、异木犀草素己糖苷含量分别为0.8、4.1、14.0 mg/g和1.3 mg/g。上述研究实验结果高于本研究结果，可能是因为原料品种提取方法及定量分析方法等存在差异。

3 结 论

赤豆作为一种药食同源的豆科植物，所含的丰富营养素和植物化学物成分受到许多研究者的关注。本实验对80%甲醇溶液提取的上清液及其中以不同键合态存在的酚类物质进行分离提取，结果表明，糖苷键合态酚类物质酚酸含量最高，可达1.44 mg/g，游离酚类物质黄酮含量最高，可达0.85 mg/g，而以酯键合态形式存在的酚类物质酚酸、黄酮含量最低，分别为1.06 mg/g和0.17 mg/g；比较3 种存在形式酚类提取物抗氧化能力，糖苷键合态提取物FRAP最强，可达15.76 mmol/g，而DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力最弱，分别为0.79、1.21 mg/g，酯键合态提取物DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力最强，分别为1.54、3.50 mg/g，而FRAP最弱，为9.19 mmol/g。本实验采用UPLC-Q TOF-MS对赤豆80%甲醇溶液提取物进行定性分析，共鉴定出3 种有机酸、6 种酚酸、16 种黄酮；并使用HPLC-QQQ-MS对其中11 种酚类物质进行定量分析，结果表明赤豆中含有丰富的儿茶素和芦丁类化合物，本研究可为赤豆的进一步高值化开发利用提供科学数据。