抗菌性无定型纳米二氧化钛/聚乳酸膜的制备及表征

尹忠琳，陈桂芸，曲亮璠，陈 野，邢鸿雁*

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.天津科技大学机械工程学院，天津 300457）

聚乳酸（polylactic acid，PLA）来源于可再生资源（淀粉、纤维素等），由于其具有透明、生物相容性和可加工性的特点，而且在废弃后可以完全生物降解为CO2和H2O，PLA可以作为替代传统石油基包装塑料，帮助解决环境污染问题[1-3]。为保证食品品质与安全性，使用环境友好型PLA和金属纳米粒子抗菌剂生产安全的抗菌包装薄膜，成为食品包装材料方面的研究热点。金属纳米粒子（AgNPs、TiO2、ZnO等）[4-6]的抗菌活性强，耐热性好，在食品腐败控制中起着重要作用[7]，而被广泛研究。

纳米二氧化钛（TiO2）由于具有惰性、无毒、光催化抗菌性能，是一种提高PLA膜整体性能的理想抗菌剂。TiO2的抑菌作用是由于光催化过程中产生羟基自由基和活性氧，细菌细胞膜是活性氧主要的攻击位点，导致脂质过氧化，细胞膜损伤，最终导致细胞裂解和死亡[8]。

纳米TiO2一般有4 种晶体形状（TiO2（B）、锐钛矿、金红石、板钛矿）和无定型[9]。很多研究报道PLA和金红石型和锐钛矿TiO2纳米复合材料提高了力学性能、热性能和降解速率[10-12]。但是，可见光利用率低的缺点成为困扰TiO2光催化抗菌技术发展的问题之一。无定型纳米TiO2结构上不同于晶态TiO2，具有不同于晶态纳米TiO2的电子结构和光学性质。因此，无定型纳米TiO2有望成为解决TiO2可见光利用率低的途径之一[13]。Kong Long等[14]的研究中得到了相似的宽衍射峰结果，在他们研发的光催化剂中掺入无定型纳米TiO2涂层，由于其吸收太阳光，光生电子-空穴分离和耐蚀性，使催化剂的光催化性明显提高。有研究通过溶胶-凝胶法合成无定型TiO2纳米粒子，探究其对大肠杆菌菌株的实际杀菌作用[15]。鉴于其潜在的技术应用，目前对研究无定型TiO2纳米粒子的光催化抗菌性能越来越有兴趣，然而无定型纳米TiO2和聚合物复合材料的研究却鲜有报道。

PLA和纳米TiO2抗菌复合材料应该有很好的应用前景，但是制备这种纳米复合材料的难题是，当纳米粉末与PLA直接混合时，纳米TiO2在PLA基质内容易聚集，严重聚集会降低光催化抗菌性。因此，找到一种合适的方法提高纳米TiO2分散性已成为研究工作的关键。

本实验采用溶胶-凝胶法水解异丙醇钛制备无定型纳米TiO2溶液，对其粒径优化及结构进行表征。为提高纳米TiO2在PLA膜中的分散性，本实验将纳米TiO2溶液与PLA溶液混合后，通过流延法制备PLA/nano-TiO2复合膜，并对其理化性质与抗菌性能进行研究，旨在提高新型可生物降解抗菌PLA基包装材料的力学性质，阻隔性能，延长食品货架期，以及为进一步实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

异丙醇钛（titanium tetraisopropoxide，TTIP）（≥97%） 上海Sigma-Aldrich公司；PLA（6202D）美国Nature Works公司；二氯甲烷、浓盐酸、冰乙酸、无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司；大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌 天津科技大学食品工程与生物技术学院菌种保藏室。

1.2 仪器与设备

Rigaku D/Max2500v/pc型X-射线衍射仪 日本理学公司；RGF5型电子万能实验机 深圳市瑞格尔仪器有限公司；Nicolet iS50型傅里叶变换红外光谱仪 美国赛默飞世尔科技有限公司；JY-82A型视频接触角测定仪承德鼎盛试验机检测设备有限公司；E-201-C-9型紫外-可见分光光度计 上海罗素科技有限公司。

1.3 纳米TiO2制备及结构

1.3.1 溶胶-凝胶法制备纳米TiO2

采用溶胶-凝胶法制备纳米TiO2。选用TTIP作为前驱反应物。所用分散剂为乙醇，由于TTIP易于水解，采用冰乙酸，盐酸协同调控TTIP的水解速度。将超纯水、盐酸、无水乙醇以物质的量比2.5∶0.15∶30的比例混合均匀作为 A 液，TTIP、无水乙醇、冰醋酸按照物质的量比为1∶1.51∶20混合均匀作为B液，TTIP 在转速1 000 r/min搅拌的状态下滴加到乙醇和冰醋酸的混合液中。然后将A液缓慢滴加到B液（不断地用磁力搅拌器充分搅拌），继续搅拌60 min（1 000 r/min）后超声分散60 min形成透明的前驱液。反应式如下：

1.3.2 纳米TiO2粒径的优化

选取对粒径影响较大的水添加量为变量，采用激光纳米粒度分别对不同水添加量的TiO2溶液（TTIP、H2O物质的量的比为1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5）的粒径进行测试，每个样品重复测试3 次，取平均值。

1.3.3 纳米TiO2的傅里叶变换红外光谱表征

准确称取1 mg纳米TiO2溶液自然干燥后的粉末于玛瑙研钵中，加入150 mg溴化钾，迅速充分研磨使其混合均匀，然后将研磨好的粉末置于压片机内真空压片60 s后取出，使用傅里叶变换红外光谱扫描仪进行检测。

1.3.4 纳米TiO2的X射线衍射表征

样本扫描衍射角2θ范围10°～70°，电压和电流分别为40 kV和200 mA。

1.3.5 纳米TiO2的紫外-可见光谱表征

采用紫外-可见分光光度计对纳米TiO2粉末进行扫描，波长范围为200～900 nm。

1.3.6 PLA/nano-TiO2复合膜制备及性质测定

1.3.6.1 PLA/nano-TiO2复合膜制备

将2 g PLA溶解在二氯甲烷中配制4% PLA溶液。经超声200 W均质至完全溶解。在PLA溶液中加入不同质量分数的粒径最优组TiO2溶液，200 W功率超声分散30 min，TiO2质量为PLA质量的0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%。然后将成膜液倒入聚丙烯模具（150 mm×250 mm），在通风橱中室温下挥发溶剂，制备厚度均匀的薄膜，膜厚度为（0.040±0.005）mm。制备的薄膜在相对湿度为（55±2）%条件下平衡7 d，性质稳定后进行测定。

1.3.6.2 PLA/nano-TiO2复合膜扫描电子显微镜观察

使用扫描电子显微镜观察PLA膜和复合膜的断面微观结构。首先将样品分别用液氮进行脆断，选取断面平齐的样品，将其固定在样品台上，并进行真空镀金操作处理，然后对样品横断面结构进行观察。

1.3.6.3 力学性质的测定

使用RGF5型号电子万能实验机进行拉伸力学性能，采用GB 3830—1983《软聚氯乙烯压延薄膜（片）》方法对PLA/nano-TiO2复合膜的拉伸强度和断裂伸长率进行测定[16]。PLA/nano-TiO2复合膜样品长度为100 mm，其中夹距为50 mm，有效宽度为10 mm的矩形，控制拉伸速率为20 mm/min。将平衡后的复合膜立即进行力学性质的测定，对每一复合膜样品进行5 次重复测试。实验测量的环境温度为（25±1）℃。

1.3.6.4 PLA/nano-TiO2复合膜接触角测定

将5 μL去离子水滴在PLA/nano-TiO2复合膜样品表面，以5 次/s的速率连续拍照3 s，记录液滴在膜表面的形状变化，测定接触角。测定复合膜的正面，每张样品随机选取5 个位置进行测定。以平衡接触角作为静态角，平均值为静态接触角。接触角定义为水滴基线与水滴与表面接触点的切线之间的角度。使用自带软件估计接触角。

1.3.6.5 PLA/nano-TiO2复合膜吸水率测定

将PLA/nano-TiO2复合膜，在50 ℃条件下恒温干燥（24±1）h，取出后放在干燥器中冷却至室温后称质量m1，然后将干燥称质量的样品浸入（23±1）℃的去离子水中（24±1）h后取出，用干燥洁净的纱布擦干，立即称质量，所得吸水后的质量m2；然后将吸水后的样品于50 ℃恒温干燥（24±1）h后，在干燥器中冷却后称质量m3，根据计算公式得出的即为吸水率，每个样品做3 个平行试样。校正质量增加是考虑由于各种溶解现象可能造成的样品质量损失，完全干燥预先浸入的样品并将其质量与其初始质量比较。吸水率按式（3）计算：

1.3.6.6 PLA/nano-TiO2复合膜水蒸气透过率测定

根据GB 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸气性试验方法 杯式法》的方法，采用拟杯子法测定PLA/nano-TiO2复合膜的水蒸气透过率[17]。选择平整，无破损的薄膜，将样品裁成直径为25 mm的圆片，随机选择5 个点，测量膜厚度后求平均值，然后用封口膜密封在锥形瓶瓶口处，锥形瓶中放在4 g无水CaCl2干燥剂，然后放置在温度为25 ℃，相对湿度为81%的干燥器中，24 h之后测试杯子中的质量。每个样品进行3 次重复实验。计算如式（4）所示：

式中：WVP为水蒸气透过率/（（g·m）/（m2·h·Pa））；t为测量时间/h；L为膜厚度/m；ΔP内外水蒸气压差/Pa；S为膜的测试面积/m2；Δm为水蒸气迁移量/g；纯水在25 ℃时的饱和水蒸气压为3.167 1 kPa。

1.3.7 PLA/nano-TiO2复合膜的抗菌性能表征

1.3.7.1 培养基的制备

TSA培养基：称取40 g TSA培养基溶解于1 000 mL蒸馏水中，加热至溶解，置于灭菌锅中121 ℃高压灭菌15 min。

LB液体培养基：称取蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化钠5 g于1 000 mL蒸馏水中，加热煮沸至全部溶解，调节pH 7.0，置于121 ℃灭菌20 min。

1.3.7.2 复合膜的抑菌圈测定

本实验选择PLA膜和PLA/nano-TiO2复合膜作为抑菌实验的实验片，用打孔器打成直径为6 mm的小圆片。将大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌用生理盐水稀释到合适浓度（106CFU/mL左右），吸取100 μL的菌悬液接种到已灭菌培养基平板上，涂布均匀。将薄膜实验片分别置于3 种细菌的培养皿中，并将培养皿置于紫外光下照射3 h后采用暗光处理，倒置在恒温培养箱中培养37 ℃，10～12 h后观察有无抑菌圈，使用数显卡尺测量并记录抑菌圈直径大小，每个样品进行3 次重复实验[18]。

1.4 数据统计分析

实验数据使用SPSS 22进行分析，采用Duncan多重检验（P＜0.05）分析数据显著性。数据表示为 ±s。

2 结果与分析

2.1 纳米TiO2结构测定

2.1.1 纳米TiO2粒径优化

如图1所示，当n（TTIP）∶n（H2O）为1∶1.5、1∶2.0时，TTIP能够充分水解，并在聚合过程中形成的粒子粒径较小，但形成的粒子比表面积大，表面能较高，容易团聚，导致最终粒径较大。当TTIP使用量增大时，水解聚合过程中形成的纳米粒子的尺寸粒径会增大，相应的表面能降低，从而粒子间团聚的几率减小，最终粒径较小；而随着水量的进一步增多，相同的TTIP浓度和水溶液滴加速度，水解迅速，成核作用速度快，不利于粒子分散，导致团聚，粒径变大[19]。所以得到最佳水添加量为n（TTIP）∶n（H2O）=1∶2.5时，纳米TiO2粒径最小为6.29～11.1 nm。

图 1 不同水添加量制备的纳米TiO2粒径Fig. 1 Particle size distribution of nano-TiO2 solutions

2.1.2 纳米TiO2红外光谱分析

图 2 纳米TiO2的红外光谱图Fig. 2 FTIR spectrum of nano-TiO2

如图2所示，TiO2纳米颗粒在3 424 cm-1处与1 630 cm-1有吸收峰，这是由于—OH官能团伸缩振动，而在2 923 cm-1和2 853 cm-1附近吸收峰对应于前驱体样品所含有机物的C—H键伸缩振动；1 460 cm-1处吸收峰则对应于—CH3的伸缩振动。500～1 000 cm-1之间观察到宽吸收峰，这是由于Ti—O—Ti伸缩振动[13]。Hashimoto等[20]研究发现TiO2纳米粒子中也观察到在500～1 000 cm-1之间TiO2的Ti—O—Ti特征吸收峰。

2.1.3 纳米TiO2的X射线衍射分析

图 3 纳米TiO2的X射线衍射图谱Fig. 3 XRD diffractogram of nano-TiO2

如图3所示，在样品衍射谱中没有衍射峰出现，只有在22°处出现了宽衍射包，表明制备的纳米TiO2为无定型结构。Kong Long等[14]使用溶胶凝胶法制备的非晶态纳米TiO2凝胶在25°处出现宽峰，和本研究结果相似。其将光催化剂中掺入非晶态TiO2涂层，由于非晶态纳米TiO2涂层中“缺陷”的分配，提供了捕获和消耗空穴的机会，使催化剂更有效的利用太阳能，解决可见光利用低这一问题。

2.1.4 纳米TiO2的紫外-可见光谱分析

图 4 纳米TiO2的紫外-可见光谱图Fig. 4 UV spectrum of nano-TiO2

如图4所示，纳米TiO2在200～400 nm波长处有紫外吸收，其中在294 nm波长处具有强吸收峰，表明纳米TiO2有强的紫外吸收性。在400～800 nm波长范围也有一定吸收，表明合成的TiO2可以将其吸光度从紫外范围内延伸到可见光区[21]。李昭青[13]也在研究中发现常见的锐钛矿纳米TiO2在可见光区几乎没有吸收，合成的非晶态TiO2较晶态TiO2在可见光范围内吸收强度增强。所以合成的无定型TiO2在光催化过程中有一定的可见光利用率，使其作为抗菌包装材料有更好的性能。

2.2 纳米TiO2质量分数对PLA/nano-TiO2复合膜理化性质的影响

2.2.1 复合膜扫描电子显微镜分析

图 5 PLA/nano-TiO2复合膜的断面扫描电子显微镜图（×10 000）Fig. 5 SEM cross-sectional views of PLA/nano-TiO2 composite films ( × 10 000)

由图5可以看出，PLA/nano-TiO2复合膜上的纳米颗粒已经均匀分散，薄膜上几乎没有聚集体。但当TiO2量分数为1%时局部出现了较大的颗粒团聚。这是因为当TiO2质量分数较低时，超声波处理作用比较明显，表面颗粒少且小，当纳米TiO2质量分数较高时，仅靠超声波处理难以使所有纳米TiO2分散均匀，因此在薄膜中局部出现了颗粒团聚现象。复合膜中纳米TiO2颗粒分散均匀，能够有好的光催化和抗菌效果。

2.2.2 纳米TiO2质量分数对PLA/nano-TiO2复合膜力学性质的影响

图 6 纳米TiO2质量分数对复合膜拉伸强度和断裂伸长率的影响Fig. 6 Effect of nano-TiO2 concentration on tensile strength and elongation at break of composite films

如图6所示，在相同牵伸倍数条件下，与纯PLA相比，PLA/nano-TiO2复合膜物拉伸强度提高。由于它们之间的界面张力低，所以在PLA基质中纳米TiO2有良好分散性，基质和纳米颗粒之间有良好的界面黏合性。PLA/nano-TiO2复合膜的拉伸强度随着纳米TiO2颗粒质量分数的增加而增加，并且在质量分数为0.6%的复合膜出现最大值63.3 MPa。进一步增加纳米TiO2质量分数到1.0%时，拉伸强度降低。纳米TiO2部分的聚集开始占主导地位并且抑制了界面相互作用，因此拉伸强度降低。另一方面，添加纳米TiO2的复合膜断裂伸长率降低。这是由于物理交联的作用使分子链滑移减少，导致膜的延展性降低[22]。当纳米TiO2质量分数较高时，纳米粒子间的碰撞几率增大，出现局部团聚现象而使薄膜的应力集中点增多，同时结晶作用减弱，导致拉伸强度下降，断裂伸长率有所回升。Lu Xili等[23]报道g-TiO2/PLLA和TiO2/PLLA纳米材料比纯PLA膜有更高的拉伸强度、更低的断裂伸长率，与本研究有相似的结论。

2.2.3 纳米TiO2质量分数对PLA/nano-TiO2复合膜接触角的影响

如图7所示，纯PLA膜接触角为78.40°，PLA/nano-TiO2复合膜的接触角均低于纯PLA膜。徐克等[24]也在TiO2/SiO2薄膜研究中发现，无定型纳米TiO2薄膜有较好的亲水性，纳米TiO2加入降低了复合膜的接触角。这是由于TiO2吸收，在其表面形成电子空穴，其中电子和Ti4+反应生成Ti3+，空穴与桥阳离子反应生成氧空位。空气中的水分子解离吸附在氧空位中，成为化学吸附水，进一步吸附空气中的水分，即在Ti3+缺陷周围形成高度缺水的微区，类似毛细现象[25]，所以降低了复合膜的接触角。其中PLA/1.0% TiO2复合膜接触角最小，为72.83°，复合膜表面更亲水。亲水性复合膜可以在一定程度上提高降解速度，更适合作为环境友好型包装材料。

2.2.4 TiO2质量分数对PLA/nano-TiO2复合膜吸水率的影响

图 8 纳米TiO2质量分数对复合膜吸水率的影响Fig. 8 Effect of nano-TiO2 concentration on water absorption rate of composite films

图8显示：纯PLA膜吸水率为0.56%，PPLA/nano-TiO2复合膜的吸水率显著高于纯PLA膜，纳米TiO2质量分数1.0%纳米复合膜的吸水率最高可达1.48%。这是由于纳米TiO2的高化学活性使纳米颗粒微粒很容易进入到高分子链的不饱和键周围，通过毛细作用吸水增加，所以吸水率增高[26]。其中纳米TiO2质量分数0.6%复合膜吸水率在复合膜中较低为1.31%，归因于基质和纳米填料之间良好界面粘合的形成减少了通过毛细管作用吸收水分。因此整体结果为纳米TiO2的加入使PLA/nano-TiO2复合膜吸水率提高。

2.2.5 纳米TiO2质量分数对PLA/nano-TiO2复合膜水蒸气透过率的影响

由图9可知，纯PLA膜水蒸气透过率为3.46×10-8（g·m）/（m2·h·Pa），PLA/nano-TiO2复合膜水蒸气透过率比纯PLA膜高，随着纳米TiO2质量分数增加水蒸气透过率呈现先减小后增加的趋势。在纳米TiO2质量分数0.6%复合膜水蒸气透过率较小，为3.98×10-8（g·m）/（m2·h·Pa），这可能是由于复合膜更加致密，水蒸气透过受阻。Xing Yage等[27]研究中纳米TiO2和密，水蒸气透过受阻。Xing Yage等[27]研究中纳米TiO2和聚乙烯复合膜也有相似的结果，复合膜水蒸气透过率提高可能是因为纳米TiO2的添加，增加了透过复合膜水蒸气的量，这可以使包装环境中保持更高的水分子交换，避免包装纸过高的相对湿度，可以延缓果蔬腐烂，延长保质期。

图 9 纳米TiO2质量分数对复合膜水蒸气透过率的影响Fig. 9 Effect of nano-TiO2 concentration on water vapor permeability of composite films

2.3 TiO2质量分数对PLA/nano-TiO2复合膜抗菌性的影响

如表1所示，观察不到纯PLA膜对大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈，而PLA/nano-TiO2复合膜有明显的抑菌性。其中PLA/0.6% nano-TiO2复合膜对大肠杆菌（24.02 mm）的抑制区直径显着大于PLA和其他纳米复合膜（P＜0.05）。PLA/0.6% nano-TiO2和0.8% nano-TiO2的复合膜对沙门菌的抑菌效果最好。PLA/0.4% nano-TiO2纳米复合材料对金黄色葡萄球菌的抗菌活性最强，抑菌圈直径为26.52 mm。

表 1 PLA/nano-TiO2复合膜的抑菌圈直径Table 1 Diameter of inhibition zone of harmful bacteria when exposed to PLA/nano-TiO2 composite filmsmm

复合膜有显著的抗菌作用，紫外光激活的TiO2纳米粒子的抗菌行为有过报道[28]。TiO2在紫外光下通过反应产生光生电子（e-）和空穴（h+）：

这两种物质可以与细胞壁，细胞膜或者细胞内成分发生化学反应，并氧化蛋白质，脂类等物质会产生杀菌作用。其中表1显示PLA/nano-TiO2复合膜对金黄色葡萄球菌的抑制作用比大肠杆菌和沙门菌更强。Tallósy等[29]也观察到相似结果，由于肽聚糖对细胞的保护作用和对抗菌剂的敏感性，而革兰氏阳性菌的细胞壁外部部分主要是肽聚糖组成，所以更容易受到抑菌剂的影响。

由于无定型纳米TiO2颗粒具有“高的表面与体积比”，所以在表面状态下可能出现“捕获”孔，从而表面上比在体中形成更多的缺陷。所以制备的无定型TiO2可能由于更好地捕获空穴与菌体发生反应，而在PLA/nano-TiO2复合膜有良好的抑菌作用。Vargas等[30]发现无定型纳米TiO2具有很多缺陷的表面，这将对杀菌作用产生影响。此外，反应式如下[31]：

Pham等[32]研究也发现无定型纳米TiO2结构导致了大量的O空位减少，其中O空位和缺陷态可能比晶体结构的TiO2更多，有利于捕获空穴。

3 结 论

通过溶胶-凝胶法制备有一定可见光利用率的无定型纳米TiO2粒子，优化得到水添加量为n（TTIP）∶n（H2O）=1∶2.5时，粒径最小为6.29～11.1 nm。为提高纳米TiO2在PLA基质中分散性，以不同质量分数的最优粒径组纳米TiO2溶液和PLA溶液混合制备PLA/nano-TiO2复合膜。随着纳米TiO2质量分数的增加，PLA/nano-TiO2复合膜力学性质、亲水性、吸水性与水蒸气透过性都显著提高。其中纳米TiO2质量分数0.6%时拉伸强度最大。PLA/nano-TiO2复合膜拉伸强度随着纳米TiO2质量分数增大而出现先增大后降低的趋势；断裂伸长率呈现相反趋势。复合膜的抑菌性实验结果可知，添加无定型纳米TiO2的PLA/nano-TiO2复合膜在紫外光照下有一定的抑菌效果。PLA/nano-TiO2复合膜可作为抗菌包装材料，在延长食品贮藏期领域有较好的应用前景。