鹰嘴豆非淀粉多糖的分离纯化及结构表征

胡爱军，李 杨，郑 捷,*，李 志，马立新

（1.天津科技大学新农村发展研究院，省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

鹰嘴豆为豆科鹰嘴豆属（Leguminosae）植物，在我国的新疆、甘肃、山西、河北等省具有极为丰富的资源。鹰嘴豆是一种高营养价值食用豆，富含多种植物蛋白和氨基酸、维生素、粗纤维及钙、镁、铁、黄酮类物质、甾体类化合物、脂肪酸类化合物[1-2]等生物活性成分和抗氧化活性成分[3]，具有降低人体血液中胆固醇含量[4]、有效控制血糖[5-6]、抑制瘤细胞生长、改善肠道功能[7]等作用，而且已有研究表明鹰嘴豆多糖具有抗疲劳的功效[8]，因此对鹰嘴豆多糖的提取、分离、纯化研究必不可少。

目前虽然有关鹰嘴豆多糖的提取已有相关报道[9]，但均未除去多糖中的淀粉部分并对其进行进一步分离与纯化，而有关其非淀粉多糖的理化性质与结构分析鲜见报道。本实验通过酶处理与柱分离得到鹰嘴豆非淀粉中性和酸性多糖并对其结构和性质进行分析，旨在对其多糖结构进行进一步的研究与分析，并为鹰嘴豆多糖资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鹰嘴豆（产自新疆木垒县）。

耐高温淀粉酶、高转化率糖化酶、乙醇、正己烷、浓硫酸、氢氧化钠、葡萄糖、氢氧化钙、正丁醇、醋酸、盐酸、甲醇、二乙胺基乙基纤维素（diethylaminoethyl cellulose，DEAE）、葡聚糖凝胶、硼氢化钠、三氟乙酸等均为分析纯；单糖标品：鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、山梨糖均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

FZ102型微型植物粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；752型紫外-可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；LGJ0.5型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；层析柱（1 cm×17.5 cm） 上海沪西分析仪器厂；CTO-20A柱温箱、RLO-10Z示差折光检测器 日本岛津公司；Lab Alliance 525高效液相色谱仪 美国兰博公司；HW·SY21-K电热恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司；PHS-3BW型pH计 上海理达仪器厂；VECTOR 22傅里叶变换红外光谱仪 布鲁克仪器公司；Phlips XL-3扫描电子显微镜 日本电子公司。

1.3 方法

1.3.1 鹰嘴豆非淀粉多糖的制备

干燥的鹰嘴豆种子经微型粉碎机粉碎，过60 目筛，以正己烷作为溶剂回流12 h进行脱脂处理，超声功率180 W、料液比1∶15（g/mL）、提取时间45 min进行超声提取，离心取上清液，获得鹰嘴豆粗多糖溶液。将制得的鹰嘴豆粗多糖溶液加入耐高温α-淀粉酶，酶添加量12 U/g，pH 6、93 ℃处理0.5 h之后，加入高转化率糖化酶，酶添加量300 U/g、pH 4.5、60 ℃处理4 h；取上清液真空浓缩，以Sevag法进行脱蛋白处理，重复8 次，离心获得上清液；将上清液中按1∶4的比例加入95%乙醇溶液，4 ℃醇沉24 h，离心，真空干燥获得非淀粉多糖粉末（经碘-碘化钾反应检测表明粗多糖中不含淀粉）。

1.3.2 鹰嘴豆非淀粉多糖的柱分离纯化[10-11]

将非淀粉多糖粉末加入蒸馏水溶解，进行DEAE-52纤维素柱纯化，分别用蒸馏水和不同浓度的氯化钠溶液为洗脱液，分步收集，苯酚-硫酸法检测，分别获得鹰嘴豆中性粗多糖和酸性粗多糖；将获得的中性粗多糖和酸性粗多糖组分用Sephadex G-75凝胶柱进行进一步纯化，以三蒸水洗脱，冻干后分别获得中性多糖和酸性多糖粉末。

1.3.3 紫外光谱测定[12]

取纯化后的中性多糖、酸性多糖配成1 mg/mL的溶液，以蒸馏水作空白对照，通过紫外-可见分光光度计进行全波长扫描。

1.3.4 气相色谱测定

1.3.4.1 标准单糖衍生物的制备[13]

各取2.0 mg岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、山梨糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖8 种单糖标准品置于安瓿瓶中，各加入30 mg硼氢化钠（NaBH4），2.0 mL蒸馏水，放置1.5 h，60 ℃减压蒸发至干，再加入0.1%盐酸-甲醇溶液2 mL，振荡溶解，减压蒸发至干，重复4 次，剩余物质置于105 ℃烘箱加热15 min，加入0.5 mL吡啶和0.5 mL醋酸酐，封管，沸水浴中反应1 h。将水相过膜，取3 μL进样。

1.3.4.2 鹰嘴豆非淀粉多糖衍生物的制备

称取鹰嘴豆中性多糖、酸性多糖样品各10 mg置于安瓿瓶中，加入1.0 mL的2 mol/L三氟乙酸溶液，封管，置于烘箱120 ℃水解4 h，冷却收集水解液，过滤，60 ℃减压浓缩至干，水解后样品加入30 mg NaBH4和2 mL蒸馏水，按1.3.4.1节中方法对非淀粉多糖进行衍生化反应，反应产物进行气相色谱分析。

1.3.4.3 气相色谱条件[14]

毛细管色谱柱OV-1701（30 m×0.32 mm，0.5 μm）；氢火焰离子化检测器；H2流量40 mL/min，空气流量450 mL/min，N2流量34 mL/min；程序升温：初温150 ℃，保留1 min，以10 ℃/min升温至200 ℃，保留10 min，继续以5 ℃/min升温至220 ℃，保留5 min，最后以1.5 ℃/min升温至终温度240 ℃，并保留20 min。进样口温度240 ℃；检测器温度280 ℃；进样量3 μL；分流比10∶1。

1.3.5 红外光谱测定[15]

各取1 mg的中性多糖与酸性多糖，分别与150 mg溴化钾粉末在玛瑙研钵中研磨，研磨至极细粉末后压片。在4 000～400 cm-1范围内进行红外光谱扫描。分辨率：4 cm-1，扫描次数：32 次，记录红外光谱图。

1.3.6 扫描电镜观察

选取适量干燥的鹰嘴豆中性多糖和鹰嘴豆酸性多糖样品用导电胶粘于载物台上，置于离子溅射仪内镀一层导电金膜后，用扫描电镜观察，并于不同倍数下拍照。

1.4 数据处理

数据处理及曲线绘制均使用OriginPro 8处理，气相色谱检测结果使用仪器自带软件处理，红外数据处理使用OMNIC软件处理。

2 结果与分析

2.1 DEAE-52纤维素柱纯化结果

图 1 DEAE-52洗脱曲线Fig. 1 DEAE-52 elution curve

从洗脱曲线（图1）可以看出，在该洗脱条件下得到4 个尖锐的洗脱峰，分别是以蒸馏水及0.05、0.1、0.2 mol/L NaCl溶液洗脱得到。这是由于鹰嘴豆多糖在以蒸馏水作洗脱溶液时，有些不带电或者带有很弱的负电荷，不能被DEAE-52纤维素吸附或者吸附很弱，首先随着蒸馏水洗脱下来，即是图中的第1个洗脱峰。而另外带有负电荷的部分，被DEAE-52纤维素所吸附，必须用比DEAE-52吸附更强的Cl-、OH-来洗脱，才能将其洗脱下来。由洗脱曲线可以看出，在以不同浓度NaCl洗脱时均能得到或高或低的洗脱峰，考虑到节省时间和节约成本等因素，选取第1个峰位置与第4个峰位置进行收集，即分别以蒸馏水和0.2 mol/L NaCl溶液作为洗脱液，洗脱下的多糖分别为鹰嘴豆中性粗多糖和鹰嘴豆酸性粗多糖[16]。

2.2 Sephadex G-75凝胶柱纯化结果

图 2 中性多糖（a）和酸性多糖（b）Sephadex G-75凝胶柱层析洗脱曲线Fig. 2 Elution curves of neutral polysaccharide (a) and acidic polysaccharide (b) on Sephadex G-75 column

由图2可知，鹰嘴豆中性多糖经Sephadex G-75凝胶柱纯化后得到两个组分，由于第2个峰较小，考虑时间的问题，选取第1个大峰的对称点收集[17]。鹰嘴豆酸性多糖经Sephadex G-75凝胶柱纯化后得到3 个组分，由于第2、第3个峰较小，因此选取第1个峰的对称点收集，将曲线上对称部分的多糖合并，浓缩，冷冻干燥，备用。

2.3 紫外光谱分析

图 3 中性多糖（a）和酸性多糖（b）紫外光谱图Fig. 3 UV spectra of neutral polysaccharide (a) and acidic polysaccharide (b)

由图3可见，鹰嘴豆中性多糖和鹰嘴豆酸性在195 nm波长处有明显的吸收峰，此为多糖的特征吸收峰；而在260 nm和280 nm波长处均无吸收峰，这表明两种多糖均不含核酸、蛋白质以及肽类等杂质[18]。

2.4 气相色谱分析结果

标准单糖气相色谱见图4。由图5可知，鹰嘴中性多糖的单糖组成主要有甘露糖（36.677%）、葡萄糖（31.349%）、半乳糖（20.984%），其次还含有一定量的阿拉伯糖、鼠李糖、及少量的岩藻糖和木糖[19]。以岩藻糖为标准，其单糖组成的物质的量比为鼠李糖∶岩藻糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖=2.48∶1∶3.92∶0.87∶32.82∶18.79∶28.06。鹰嘴酸性多糖的单糖组成主要有半乳糖（38.585%）、葡萄糖（20.669%）、甘露糖（14.28%），其次还含有一定量的鼠李糖、阿拉伯糖及少量的木糖和岩藻糖。以岩藻糖为标准，其单糖组成的物质的量比为鼠李糖∶岩藻糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖=2.22∶1.00∶3.92∶2.10∶5.92∶15.99∶8.57。

图 4 标准单糖气相色谱图Fig. 4 GC chromatogram of standard monosaccharaides

图 5 鹰嘴豆中性多糖（a）和酸性多糖（b）气相色谱图Fig. 5 GC chromatograms of chickpea neutral polysaccharide (a) and acidic polysaccharide (b)

2.5 红外光谱分析结果

图 6 中性多糖（a）和酸性多糖（b）的红外光谱图Fig. 6 FTIR spectra of neutral polysaccharide (a) and acidic polysaccharide (b)

如图6所示，3 500～3 200 cm-1有一吸收较强的宽峰，此峰是O—H和C—H的伸缩振动，为糖类物质的特征吸收峰[20-22]，3 414 cm-1处的峰说明鹰嘴豆中性多糖存在明显的分子间氢键。在3 000～2 800 cm-1和1 400～1 200 cm-1范围内出现的强吸收峰是糖类C—H伸缩振动和变角振动，可初步判断该化合物为糖类化合物[23-25]。1 643 cm-1处出现吸收峰说明鹰嘴豆多糖有一定量的结晶水存在。1 200～1 000 cm-1出现的是吡喃糖环的醚键（C—O）和羟基吸收峰[26]。836 cm-1处出现吸收峰，说明鹰嘴豆中性多糖含有α-型糖苷键[27]；从鹰嘴豆非淀粉酸性多糖的红外光谱图中可以分析出：在3 600～3 200 cm-1和3 000～2 800 cm-1处出现的两组吸收峰是糖的特征吸收峰。1 647 cm-1为羰基（—CHO）的C＝O伸缩振动，1 418 cm-1出现的明显峰为羧基（—COOH）的C—O伸缩振动。1 200～1 000 cm-1之间的吸收峰是由两种C—O键伸缩振动所形成[28]。鹰嘴豆酸性多糖在1 075 cm-1处有一明显的吸收峰，说明含有硫酸根。红外光谱不存在1 616 cm-1的—NH2和—NH3+的特征吸收峰，说明不存在蛋白多糖，895 cm-1处出现一弱峰为吡喃环的β-端差向异构的C—H变角振动[29-30]。

2.6 扫描电镜分析结果

图 7 中性多糖扫描电镜图Fig. 7 SEM images of neutral polysaccharide

图 8 酸性多糖扫描电镜图Fig. 8 SEM images of acidic polysaccharide

如图7、8所示，通过扫描电镜观察鹰嘴豆中性多糖与鹰嘴豆酸性多糖的形貌，分别放大100 倍和500 倍，其扫描电镜结果表明，鹰嘴豆中性多糖呈树枝状，鹰嘴豆酸性多糖呈现卷曲的片状。

3 结 论

鹰嘴豆粗多糖经除淀粉、除蛋白之后通过DEAE-52纤维素和Sephadex G-75凝胶柱进行进一步的分离纯化获得鹰嘴豆非淀粉中性和酸性多糖。其在紫外波长195 nm处有明显的峰而在260 nm和280 nm波长处均无吸收峰，这表明两种多糖均不含核酸、蛋白质以及肽类等杂质；气相色谱显示两种多糖的单糖组成相同，主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，主要区别在于木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖的物质的量比的大小。中性多糖中葡萄糖含量是酸性多糖的3.27 倍；甘露糖含量是酸性多糖的5.54 倍，但是酸性多糖中木糖含量是鹰嘴豆中性多糖含量的2.41 倍。红外光谱分析表明两种多糖均含有糖类化合物的特征吸收峰且中性多糖中含有α-型糖苷键，酸性多糖中含有硫酸根。扫描电镜分析知鹰嘴豆中性多糖呈现线性结构，鹰嘴豆酸性多糖呈现卷曲的片状结构。