应用Illumina MiSeq测序技术比较风干肉中细菌多样性和微生物安全性

田建军，张开屏，杨明阳，景智波，李权威，赵丽华，靳 烨,*

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古商贸职业学院食品工程系，内蒙古 呼和浩特 010070）

风干肉是新疆、西藏和内蒙古西北地区非常有特色的一种传统中式肉制品，生产加工历史悠久，肉经风干之后，肉质松脆、口味独特、食用方便、保藏期长，产品深受当地游牧民族以及全国各地消费者的喜爱。传统自然风干肉制品是以牛、羊、马等反刍动物新鲜肉为主要原料，在冬季适宜的低温和通风良好的环境条件下，将牛羊肉割成小条，挂在阴凉处，经90～120 d自然晾晒、风干，去除肉中部分水分而形成的风味独特的肉制品，它属于自然条件下，依靠内源酶和有益微生物的作用，发生一系列生化变化而制成的一类肉制品[1-2]。在自然晾晒的过程中，来源于原料本身和环境中的微生物，特别是一些耐低温的乳酸菌和葡萄球菌仍然具有代谢活力，代谢产酸、产细菌素，抑菌的同时产生蛋白酶和脂肪酶，通过这些酶对蛋白质和脂肪进行适当降解和氧化，赋予产品独特的感官和食用品质，所以传统的风干肉是一种自然发酵的、风味独特的发酵肉制品。

乳酸菌是最早从发酵肉制品中分离出的微生物，是传统发酵肉制品中重要的优势菌群，与产品品质密切相关[3-4]。潘晓倩等[5]从农家自然发酵的腌腊肉制品中分离获得1 株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）10M-7，该菌株能迅速降低腌腊肉制品发酵初期产品的pH值，可有效抑制发酵产品中大肠杆菌和葡萄球菌的数量，提高食品的安全性能。也有研究发现，乳酸菌在降低产品pH值的同时能够赋予产品独特的发酵风味、改善产品组织结构、促进产品色泽与风味的形成[6]。同时，某些乳酸菌能产细菌素，抑制腐败菌和致病菌生长繁殖[7-9]，降低产品中某些特定生物胺的含量[10-11]。然而，绝大多数的微生物不能够被培养或者很难被培养，导致传统的分离、纯化、鉴定检测结果不准确[12]。想要全面反映自然发酵过程中微生物活动的真实状况，必须运用相对更加精确的技术来研究细菌群落结构变化的情况。

Illumina MiSeq高通量测序技术可对数百万个DNA分子同时测序，根据16S rRNA基因序列分析特定环境中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能特性[13]，具有较高准确性和灵敏度等优势[14]，现已被广泛用于对许多发酵食品微生物群体结构的分析，如奶酪、虾酱、酸马奶等[15-17]。目前发酵食品微生物多样性的研究是众多学者研究的热点，但对于传统自然发酵的风干肉的微生物结构研究少之又少。自然发酵的风干类肉制品通常会有来自原料以及与风干肉制品生产环境相关的微生物，而细菌是参与发酵肉制品发酵的主要微生物，对产品品质起决定性作用，所以对自然发酵风干肉制品的细菌多样性进行研究很有必要，可为产品的安全生产提供依据。

本研究为探究传统发酵风干肉中细菌群落结构，在内蒙古和新疆地区选取品质最有代表性的样品进行采集。对细菌16S rRNA基因序列进行高通量测序以及序列分析，进而阐述传统特色风干肉制品中细菌种群多样性，分析结果将对传统风干肉制品中微生物菌群特征的研究及产品质量监控具有参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

根据样品发酵方式将14 个样品划分为group A、group B、group C、group D四组，其中group A和group B为不同地区的自然发酵组，group C和group D为不同方式的人工调控组，详细分组情况如表1所示。

表 1 样品来源及加工方式Table 1 Information about meat product samples investigated in this study

QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒 德国Qiagen公司；Phusion超保真DNA聚合酶 英国NEB公司；DNA Marker（DL9000、DL2000） 上海欣百诺生物科技有限公司；UltraSYBR Mixture 北京康为世纪生物科技有限公司；MiSeq Reagent Kit v3 美国Illumina公司。方式下的花青素-SPI共价聚合物与天然SPI的傅里叶红外光谱图进行比较。如图3C所示，在添加同质量浓度（0.5 g/L）的花青素条件下，不同共价交联方式处理花青素与SPI致使天然SPI酰胺I带的红外吸收峰发生蓝移的程度也不同（生物酶法：1 634.38 cm-1蓝移至1 631.97 cm-1；化学碱法：1 634.38 cm-1蓝移至1 632.93 cm-1），这表明不同共价交联方式可以不同程度地改变蛋白质的二级结构。

同时利用peakfit对蛋白的酰胺I带进行去卷积，二阶求导，采用Gauss面积法拟合曲线并计算得出蛋白质二级结构的种类与含量[29]，计算结果见表1。

表 1 花青素-SPI共价聚合物中蛋白的二级结构含量Table 1 Contents of protein secondary structures in the covalent conjugates of anthocyanin and SPI %

如表1所示，与天然SPI相比，所有添加花青素样品的SPI的二级结构含量都发生了改变，其中α-螺旋和β-折叠含量降低，β-转角和无规卷曲含量明显升高（P＜0.05），这可能是由于蛋白质的α-螺旋和β-折叠逐渐转换为β-转角和无规卷曲。这与之前的研究[30]结果一致。在添加同质量浓度花青素条件下，生物酶法交联得到的花青素-SPI共价聚合物比化学碱法交联得到的聚合物增加β-转角和无规卷曲含量的趋势更加明显（P＜0.05），这表明生物酶法共价交联作用比化学碱法共价交联作用解折叠蛋白质二级结构的能力更强，可以更大程度地使部分蛋白结构展开[15]。

2.4 紫外-可见光谱分析

图 4 生物酶法和化学碱法条件下花青素与SPI共价聚合物的紫外-可见吸收光谱图Fig. 4 UV-Vis absorption spectra of the covalent conjugates of anthocyanin and SPI under enzymatic and alkaline conditions

蛋白质的吸收光谱在290 nm左右处有一个主要的吸收峰，代表蛋白质的芳香族氨基酸π-π*跃迁[31]。如图3所示，花青素的添加使SPI的紫外-可见吸收光谱峰值升高，且在同一种共价交联方式条件下，SPI的吸收光谱峰值随花青素的质量浓度升高而增加。但在同一质量浓度花青素条件下，生物酶法交联的花青素-SPI共价聚合物比化学碱法交联的聚合物峰值高。值得注意的是，花青素的添加不仅改变了SPI吸收光谱的峰值，而且使得SPI的紫外吸收光谱在290 nm波长处的峰位发生了蓝移，尤其在花青素质量浓度为0.5 g/L，生物酶法交联的聚合物峰位蓝移最为明显，由波长290 nm蓝移至287 nm。

研究表明，蛋白质吸收峰峰值的大小主要反映了蛋白质分子与其他小分子的相互作用的强弱，而蛋白质吸收峰峰位的改变主要是由于蛋白质微环境的疏水性发生改变所引起的，并且蛋白质微环境疏水性的改变会引起蛋白质构象的变化[13]。根据图4结果可知，花青素使SPI芳香族氨基酸处的微环境发生了改变，进而诱导SPI多肽链伸展，发生解折叠。同一共价交联方式下，随着花青素质量浓度升高，花青素与SPI的共价相互作用越强；而同一质量浓度花青素条件下，生物酶法交联比化学碱法交联更能促进花青素与SPI的共价相互作用。

2.5 荧光光谱分析

图 5 生物酶法和化学碱法条件下花青素与SPI共价聚合物的荧光光谱图Fig. 5 Emission fluorescence spectra of the covalent conjugates of anthocyanin and SPI under enzymatic and alkaline conditions

蛋白质被认为具有固有的发射荧光，主要是由于它们的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基。激发波长为280 nm时，苯丙氨酸可以忽略，当这些芳香族残基暴露于不同的溶剂条件下时，荧光发射光谱特征会改变[13]。如图5所示，花青素与SPI的共价交联使得SPI的荧光强度发生了猝灭现象，并且花青素质量浓度越高，SPI的荧光强度猝灭现象越明显。同一花青素质量浓度，生物酶法条件下花青素对SPI荧光强度的猝灭程度高于化学碱法条件。这说明生物酶法条件下和化学碱法条件下花青素与列鉴定聚类分析后，共得到466 975 条优化序列，每个样品平均产生33 355 条优化序列。以抽到的序列条数（测序深度）与其所聚类得到OTU数（97%相似性）和Shannon指数绘制曲线，即可得到稀释性曲线和Shannon指数曲线。

由图1可知，OTU数随着测序量的深入而增加，Shannon指数曲线也伴随着持续上升。随着逐渐增大测序量，OTU数没有达到平衡仍有上升的趋势，而Shannon指数曲线已经完全达到饱和状态，这说明虽然随着测序量的增加可能会有新的OTU和种系被发现，但是在此测序深度水平下，足以充分展现样品中细菌的多样性。对14 组发酵肉制品所含细菌进行高通量测序分析，当测序量低于10 000时，OTU数呈现显著上升趋势，说明此时的测序量仍有较多物种没有被检查到。当测序数量逐渐增加时，样品的OTU数均增加，但趋势趋于平缓，当测序深度达到40 000 条时，所有样品OTU变化均已趋于平缓，随着测序量的增加，细菌多样性几乎不再随之发生变化，说明现有测序量已经可以反映出样品中细菌丰度信息。

2.2 样本OTU分布

图 2 不同样品OTU数与分布图Fig. 2 Distribution of OTUs number in different samples

在97%相似水平下，对所有序列进行OTU划分，OTU数可以反映出样品中细菌的丰度[18]，由图2可知，西藏山南市琼结县自然风干牛肉RQ_3的OTU数最多，说明所含有的细菌种类最丰富，共有OTU数为471，西藏林芝江达县自然风干牛肉TR_1和TR_2的OTU数最为接近，分别为188和187。内蒙古乌拉特中期自然风干羊肉中细菌的种类相对丰富，BY_1、BY_2和BY_3的OTU数分布在361～265之间。内蒙古呼和浩特市采集的腊肉LR_2的OTU数为146，而在呼和浩特市采集的腊肠样品L、LS_1和实验室通过添加发酵剂进行工人调控的发酵香肠S_200和S_302的OTU分布在67～78 个之间。其中在同一环境条件下添加发酵剂的S_200和S_302较不添加发酵剂的对照组NS_1的OTU数要低。由此可见，通过添加发酵剂，可以减少发酵香肠中细菌的种类。这可能是发酵剂中乳酸菌快速产酸或产细菌素对其他微生物产生了抑制作用。美国的西式发酵香肠HT的OTU数相对较低，为60。新疆熏马肠XMC的OTU数最低，仅为40，可能与生产工艺的烟熏有关。有研究表明，烟熏能够选择性地抑制肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）等腐败微生物，延长保质期[19]。对以上14 个样品细菌丰度进行比较，样品中细菌丰度大致可归为5 类，RQ_3样品丰度值最高（471），样品中细菌的多样性程度明显比其他样品要高，BY_1次之（361），BY_2（265）和BY_3（286）、TR_1（188）和TR_2（187）基本相近，XMC（40）样品丰度值最低，可见不同地区、相同地区不同的处理方法，样品的细菌丰度分布差异较大。

Venn图可用于统计多个样本中共有和独有的OTU数，本实验选用相似度为97%的OTU，结果如图3所示，可以直观表现出样本间OTU数组成的相似性及其重叠情况。

图 3 样品中细菌群落共享和独有的OTU的Veen分析Fig. 3 Veen diagram representation of shared and exclusive OTUs from bacterial community in different samples

由图3可知，西藏地区自然发酵样品（group A）中OTU总数目为650，其中独有的OTU数为322，内蒙古乌拉特中旗自然发酵样品（group B）中OTU数为583，其中独有的OTU数为245，group A和group B中共有的OTU数为291。人工调控实验室自制样品（group C）中OTU数为147，其中独有的OTU数为1，人工调控市售样品（group D）中OTU数为203，其中独有的OTU数为30，group C和group D中共有的OTU数为91。group A、group B、group C、group D四组样品中共有的OTU数为73。

结合图2和图3分析可知，自然发酵风干肉制品中细菌的种类比人工调控发酵肉制品丰富，人工调控过程中不添加发酵剂比添加发酵剂的细菌丰富。不经过烟熏比经过烟熏的细菌种类丰富。聚类出的OTU数表现出一定的地区差异性，在数量上基本表现为传统自然风干肉＞人工调控风干肉、中式发酵肉制品＞西式发酵香肠、非烟熏发酵肉制品＞烟熏发酵肉制品。

Venn图中多个样本中共有和独有的OTU数目，所包含的微生物序列数和所占比例如表2所示。由表2可知，样本中OTU总数为975，包含的序列总数为466 975。其中4 组样品（group A、group B、group C、group D）共有的OTU数为73，所包含的序列数为362 630，占比78%，所占比例最高，其中丰度值大于1%且丰度值由高到低的OTU分别为：OTU 1、OTU 5、OTU 2、OTU 3、OTU 7、OTU 12、OTU 9、OTU 6、OTU 8、OTU 13、OTU 10、OTU 11（表2）。

表 2 样品中OTU数、序列数及其占比Table 2 OTU number, sequence number and their proportions in samples

表 3 主要OTU分布及物种信息Table 3 Main OTU distribution and species information

由表3可知，group A、group B、group C、group D四组样品中，丰度值最高的为OTU 1，序列数占比为37%，物种信息为厚壁菌门（Firmicutes）乳杆菌属（Lactobacillus）的清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei），OTU 5和OTU 2所包含的序列数占比均为6%，物种信息分别为Firmicutes的葡萄球菌属（Staphylococcus）和乳酸乳球菌属（Lactococcus）的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。OTU 3包含序列占比为3%，物种信息为变形菌门（Proteobacteria）假单胞菌属（Pseudomonas）的莓实假单胞菌（Pseudomonas fragi）。OTU 7包含序列占比为3%，属于蓝细菌门（Cyanobacteria）生物。OTU 4、OTU 12、OTU 9、OTU 6各自包含的序列数占比均为2%，其中OTU 4、OTU 12分别为Firmicutes的魏斯氏菌属（Weissella）和肠球菌属（Enterococcus），OTU 9、OTU 6分别为Proteobacteria不动杆菌属（Acinetobacter）的约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）和Anaplasma属的Anaplasma ovis。OTU 8、OTU 13、OTU 10、OTU 11序列数占比均为1%，其中OTU 13为Proteobacteria，其余OTU 8、OTU 10、OTU 11均为Firmicutes。由以上分析可知，样品中微生物丰度高的物种主要集中在Firmicutes和Proteobacteria。Firmicutes中以Lactobacillus sakei为最高，其次为Staphylococcus和Lactococcus lactis。

2.3 Alpha多样性指数分析

图 4 微生物多样性指数分析Fig. 4 Microbial diversity indexes

样品的ACE指数和Chao1指数可以反映出样品微生物群落分布丰度，由图4可以看出，4 组样品中group B的ACE指数和Chao1指数是最大的，这说明内蒙古乌拉特中期采集的风干肉中细菌物种丰度最高，且明显高于group C和group D（P＜0.05）。样品的Simpson和Shannon指数可以反映出样品中微生物群落分布的多样性，其中Shannon指数越大，表明微生物群落多样性越高，而Simpson指数越大，表明微生物群落多样性越低。由图4分析发现，人工调控组的微生物结构明显区别于自然发酵组，通过进一步对group A和group B的微生物多样性进行Alpha多样性分析，Anova分析说明4 组之间差异显著（P＜0.01），两两分析结果显示只有group B和group C、group B和group D之间差异显著（P＜0.05），其他两两组间差异不显著。

2.4 优势菌在门水平上的群落结构与微生物安全性分析

图 5 门水平物种分布柱状图Fig. 5 Phylum distribution statistics

不同样品中细菌在细菌分类门水平上的分布情况如图5所示。在自然发酵的6 个样品中（TR_1、TR_2、RQ_3和BY_1、BY_2、BY_3）共鉴定出21 个细菌门，平均丰度值大于1%的有5 个门，分别为：Firmicutes 39%、Proteobacteria 40%、Bacteroidetes 14%、Actinobacteria 4%、Cyanobacteria 1%，这5 个菌门细菌含量占到测序序列总数的97%，另外在RQ_3、BY_1、BY_2和BY_3样品中发现没有划分门（unclassified）的细菌，其平均丰度值为0.2%。在人工调控的8 个样品中（NS_1、S_200、S_302、LS_1、LR_2、L、XMC、HT）共鉴定出14 个细菌门，平均丰度值大于1%的仅有3 个门，Firmicutes 92%、Proteobacteria 4%和Cyanobacteria 4%。从自然发酵和人工调控样品细菌的分布情况来看，自然发酵样品中Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes为优势菌门，所占比例均超过了10%，人工调控样品中仅Firmicutes为优势菌群，所占比例高达92%。

革兰氏染色反应阳性的Firmicutes和革兰氏染色阴性的Bacteroidetes是人类肠道内的优势有益菌。Haberman等[20]对359 名炎性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）患者进行肠道菌群分析，发现IBD患者回肠中Firmicutes丰度降低，Proteobacteria丰度增加。这可能提示Firmicutes丰度降低与具有抗炎潜力的优势菌丰度减少相关，Proteobacteria丰度增加与致病菌丰度增加相关。近些年来研究显示，短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）主要包括乙酸、丙酸、丁酸，约占SCFAs总量的90%以上，对人体的健康有重要作用[21-22]。丙酸为是Bacteroidetes发酵的主要产物，丁酸主要由Firmicutes代谢产生[23-24]。由此推断，菌群结构不同的发酵肉制品，乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸代谢产物有所差异，进而对维持机体健康影响产生不同影响。而Proteobacteria包括大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌很多病原菌[25]，在某种程度上对风干肉具有潜在的危害性。因此，为控制这些安全隐患，可以从原料肉的处理、发酵环境、发酵温度等生产工艺进行改进，将生产标准化、规范化以此降低有害微生物污染的风险。这对于保证风干肉的质量与安全，提高风干肉的品质和营养价值具有重要意义。

2.5 优势菌在属水平上的群落结构与微生物安全性分析

图 6 属水平物种分布柱状图Fig. 6 Genus distribution statistics

不同样品中细菌在属水平上的分布情况如图6所示。自然发酵的6 个样品（TR_1、TR_2、RQ_3和BY_1、BY_2、BY_3）共鉴定出241 个细菌属，相对含量大于1.0%的属有16 个，其中属于Firmicutes和Proteobacteria的各为8 个。另外，unclassified的细菌总量占细菌菌群总量的37.99%。属于Firmicutes的细菌属分别为：Lactobacillus 4%、Staphylococcus 2%、动性球菌属（Planococcus）2%、Jeotgalicoccus 2%、环丝菌属（Brochothrix）1%、乳球菌属（Lactococcus）1%、Atopostipes 1%、链球菌属（Streptococcus）1%。属于Proteobacteria的细菌属分别为： Pseudomonas 9%、Acinetobacter 4%、红孢子虫属（Anaplasma）3%、马赛菌属（Massilia）3%、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）2%、玫瑰色半光合菌属（Roseateles）2%、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）2%、食单胞菌属（Stenotrophomonas）1%。人工调控的8 个样品（NS_1、S_200、S_302、LS_1、LR_2、L、XMC、HT）共鉴定出102 个细菌属，相对含量大于1.0%的属有8 个，都属于Firmicutes。另外，unclassified的细菌总量占到细菌菌群总量的6%。属于Firmicutes的各菌属分别为：Lactobacillus 62%、Lactococcus 9%、Staphylococcus 8%、Weissella 5%、Enterococcus 3%、环丝菌属（Brochothrix）2%、球菌属（Macrococcus）1%、明串珠菌属（Leuconostoc）1%。

发酵肉制品在发酵和成熟过程中，乳酸菌和凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococcus，CNS）被认为是2 个主要的微生物，对发酵肉制品品质特性至关重要[26-27]。乳酸菌如清酒乳杆菌（L. sakei）和植物乳杆菌（L. plantarum）可以使发酵肉制品酸化，有些菌株可能也有蛋白酶和脂肪酶活性；CNS如木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）和肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）具有较强的蛋白酶和脂肪酶活性，可以分解蛋白质和脂肪产生多肽、游离氨基酸和游离脂肪酸，对发酵肉制品的质地和风味起主要作用[28]。Tabanelli等[27]研究发现，S. xylosus和S. carnosus具有硝酸盐还原酶活性，可以促进发酵肉制品的发色作用。Wang Xinhui等[29]研究发现S. xylosus具有胺氧化酶活性而可以有效地降低组胺和其他生物胺的含量。

自然发酵与人工调控样品细菌多样性在属水平上差异显著（P＜0.05）。作为许多食品自然发酵过程中的优势菌群，乳酸菌被认为是安全的[30]，其他菌属可能存在安全隐患。Proteobacteria的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的条件致病菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌[31]。Proteobacteria的静止嗜冷杆菌（Psychrobacter immobilis）属于革兰氏阴性低温贮存条件下的腐败菌[32]。Acinetobacter属鲍曼不动杆菌是条件致病菌，当机体抵抗力降低时易引起机体感染的革兰氏阴性球杆菌。

3 结 论

本研究利用Illumina MiSeq第二代测序技术，从基因组的水平上解析风干肉制品微生物群落结构，突破了很多微生物尚不能利用培养基进行分离、纯化培养的技术瓶颈，证实风干肉制品中确实存在一定丰度的细菌，属于微生物参与发酵的发酵肉制品，显示出高通量技术在风干肉制品微生物研究中的可行性及明显优势，通过探讨风干肉中的细菌群落组成，可以把握风干肉中优势菌群的分布情况，了解优势菌群会对风干肉的质量与安全以及品质产生的影响，可为其他研究者开展同类研究提供参考。

本研究共获得466 975 条优化序列，每个样品平均产生33 355 条优化序列。OTU数最多的为471，最少的为40，平均为170。对风干肉进行微生物多样性分析后在自然发酵的6 个样品中（group A和group B）共鉴定出21 个细菌门，平均丰度值大于1%的有5 个门，分别为Firmicutes（39%）、Proteobacteria（40%）、Bacteroidetes（14%）、Actinobacteria（4%）和Cyanobacteria（1%），这5 个菌门的含量共占到测序序列总数的97%。在人工调控的8 个样品中（group C和group D）共鉴定出14 个细菌门，平均丰度值大于1%的仅有3 个门，分别为 Firmicutes（92%）、Proteobacteria（4%）和Cyanobacteria（4%）。其中Firmicutes为自然发酵和人工调控样品共同的优势菌群。自然发酵与人工调控样品分别鉴定出241 个和102 个细菌属，细菌多样性在属水平上差异显著（P＜0.05）。人工调控的8 个样品（NS_1、S_200、S_302、LS_1、LR_2、L、XMC、HT）相对含量大于1.0%的属有8 个，都属于Firmicutes。自然发酵的6 个样品（TR_1、TR_2、RQ_3和BY_1、BY_2、BY_3）相对含量大于1.0%的属有16 个，其中属于Firmicutes和Proteobacteria的各为8 个。Proteobacteria中的Pseudomonas、Acinetobacter、Psychrobacter中革兰氏阴性菌多为致病菌或腐败菌，对发酵制品存在安全隐患。

我国传统的风干肉是大众化的即食肉制品。但是多数地区风干肉在生产过程中对原料肉不做杀菌处理，卫生质量主要依靠原料肉自身和周边的环境条件，原料肉容易被致病菌或腐败菌的污染。因此，发酵肉制品因被致病菌或腐败菌污染而引起的风险应该被广泛关注。