生姜蛋白酶对干腌羊火腿品质特性的影响

阿尔祖古丽·阿卜杜外力，玉素甫·苏来曼，巴吐尔·阿不力克木*

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

生姜蛋白酶是作为一种新型植物蛋白酶，在结构与性质上与木瓜蛋白酶等植物蛋白酶具有较多的相似性，被认为是木瓜蛋白酶家族的一个新成员[1]。生姜蛋白酶食用安全，可用作嫩肉剂[2]、酒澄清剂[3]、乳制品凝固剂[4]以及大豆蛋白粉[5]等食品添加剂，它还能特异水解脯氨酸P2位含有脯氨酸的多肽和蛋白质，对脯氨酸的这种特殊亲和性使其在生化研究中成为一种很有前途的工具蛋白酶[6]。生姜蛋白酶用于肉类嫩化，不仅可以使其嫩度显著提高，还可以使其具有良好的风味。其对肉类嫩化的作用机理是通过分解胶原蛋白和肌动球蛋白（尤其是对胶原蛋白的分解能力很强）而实现的，能降解肌原纤维，导致肌原纤维的断裂而提高肉类的嫩度[7]。俞沛初等[8]通过对鸡肉、牛肉中添加不同剂量生姜汁实验，考察生姜汁对肉类有明显的致嫩效果。唐晓珍等[9]报道，生姜汁和生姜蛋白酶对猪肉的嫩化效果，并指出生姜汁可以直接在肉类嫩化中应用，确定生姜蛋白酶嫩化猪肉的最适条件。Naveena等[10]研究姜汁对印度水牛肉的嫩化效果，结果表明姜汁处理增加了样品的胶原蛋白溶解度，促进了肌浆蛋白以及肌原纤维蛋白的分解，降低了剪切力，肌肉蛋白质的电泳图案中蛋白条带数量减少，表明生姜蛋白酶具有广泛的蛋白水解能力。孙国梁[11]研究生姜蛋白酶对牛肉的嫩化效果实验，对酶用量、pH值、处理温度、处理时间进行测试，结果表明生姜蛋白酶对牛肉的嫩化效果十分显著，通过正交试验确定生姜蛋白酶对牛肉嫩化的最佳工艺条件为酶用量0.06%、pH 7.0、处理温度50 ℃、处理时间2 h。

干腌羊火腿，通过选料、修整腿坯、低温腌制、洗脱盐分、风干发酵成熟等工序，用食盐、亚硝酸盐和蔗糖干腌而成，并以其独特的风味日益受到消费者喜爱。但其生产周期长、成本高、受特殊地区气候条件限制，会影响火腿工业化生产。目前有关干腌火腿的研究主要在改善其生产工艺和内原酶对其风味的影响方面[12]；而利用外源酶，提高其嫩度并缩短其成熟期的研究鲜见报道。

本实验选用质量约为2.50～3.00 kg的巴什拜羊后腿肉，按不同添加量生姜蛋白酶制作干腌羊火腿，并以剪切力、pH值、水分含量、系水力、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值、总氮含量（total nitrogen，TN）、非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）含量以及蛋白质降解指数（proteolysis index，PI）等作为品质特性指标，通过单因素试验确定生姜蛋白酶最佳浓度，为日后干腌羊火腿的工业化生产和生姜蛋白酶在肉制品中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用新疆巴什拜羊，6～9 月龄公羊鲜后腿，购自乌鲁木齐沙依巴克区和田街新朱兰清牛羊肉配送中心。

生姜蛋白酶（酶活力≥800 U/mg） 上海鼓臣生物技术有限公司；氯化钾、三氯乙酸、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、盐酸、甲基红、溴甲酚绿、硼酸、氢氧化钠、硫代巴比妥酸、95%乙醇等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱、DK-8D电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司；雷磁PHS-3C pH计上海仪电科学仪器股份有限公司；721可见分光光度计上海菁华科技仪器有限公司；电子天平 上海上天精密仪器有限公司；TA XT plus物性测定仪 英国Stable Micro System公司；Avanti-J-26S XPI落地式高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter有限公司；Food ALYT D4000凯氏定氮仪 德国Omnilab-Laborzentrum GmbH &Co.KG公司；FSH-2可调高速匀浆机 武汉格莱莫检测设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干腌羊火腿的制作与取样

工艺流程：新鲜羊后腿→冷却修整→低温腌制→浸泡洗腿→吊挂风干→成熟→成品。

羊腿的选择和处理：选择2.50～3.00 kg左右的新鲜羊后腿12 条，去除表面可见脂肪，修成琵琶状。

低温腌制：以羊腿质量计，使用食盐3%、亚硝酸钠0.01%、蔗糖0.5%的比例混合后，分3 次撒在鲜腿表面揉搓，并在4～8 ℃腌制3 d。

酶处理：将腌制后的羊后腿随机分为对照组和实验组；再按实验组羊腿质量参照孙国梁[11]的方法分别注射生姜蛋白酶量0.01%、0.03%、0.05%，并在生姜蛋白酶最适酶活性温度50 ℃滚揉处理1.5 h。

浸洗：将酶处理后的羊后腿，用温度为10 ℃的净水浸泡清洗2 h，除去羊腿表面的污物。

吊挂风干：将浸洗后的羊腿晾干后，在相应条件下进行吊挂风干。风干前期风干条件为温度10～12 ℃、相对湿度80%～85%、风速0.8 m/s、时间5 d；风干中期条件为温度10～12 ℃、相对湿度75%～80%、风速0.8 m/s、时间7 d；风干后期条件为温度14～15 ℃、相对湿度75%～85%、风速0.8 m/s、时间8 d。

成熟：将风干后的羊腿在温度为16～18 ℃、相对湿度70%～75%、风速0.5 m/s条件下成熟7 d。

取样：以羊腿股二头肌为采样点，每组分别从鲜羊腿（0 d）、腌制（3 d）、风干前期（8 d）、风干中期（15 d）、风干后期（23 d）、成熟期（30 d）6 个工艺点取样分别记作I～VI，置于-20 ℃冷冻保藏，以备各指标的测定。

1.3.2 剪切力的测定

将肌肉切成5 g左右的小块，用TA XT plus物性分析仪测定6 个肉样的剪切力并每个样重复3 次。数值愈小，则肉愈嫩；反之，则肉愈老。

1.3.3 pH值的测定

参照GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》。将5 g肉样剁成碎末，并与5 倍体积的蒸馏水混合，高速匀浆机匀浆，室温静置10 min左右，将PHS-3C型pH计的玻璃电极直接插入肉水混合物内，并在显示屏上数字稳定后，读值。

1.3.4 水分含量的测定

参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》直接干燥法。

1.3.5 失水率与系水力的测定

取3 g左右的肉样，切成小块，精确称量（m1），并放入50 mL离心管中2 000 r/min离心20 min，离心完后用滤纸吸取肉表面水分，再次称量（m2），按公式（1）、

（2）计算其失水率和系水力：

1.3.6 TBA值的测定

按照Witte等[13]的方法，取5 g肉样切碎于离心管中，加5 倍体积20% TCA溶液和3 倍体积蒸馏水，并用高速匀浆机匀浆60 s，静置1 h，2 000 r/min离心10 min，过滤，用蒸馏水定容至50 mL，然后将5 mL滤液与0.02 mol/L TBA以体积比1∶1混合，并在100 ℃恒温水浴锅中反应20 min，取出用流动水冷却5 min，然后用分光光度计测定其在532 nm和600 nm波长处的吸光度，并按公式（3）计算同时做空白实验。

式中：A532nm为溶液在波长532 nm处的吸光度；A600nm为溶液在波长600 nm处的吸光度；155为摩尔吸光系数；m为样品质量；72.1为丙二醛的相对分子质量。

1.3.7 PI的测定

TN含量测定：参照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法；NPN含量测定：参考朱健辉[14]的方法，并略作修改。将样品自然解冻后，剔除可见脂肪和结蹄组织，切碎，称取5 g左右（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入40 mL蒸馏水，高速匀浆机匀浆3 次，于4 ℃放置1 h后，3 000 r/min离心15 min，用快速滤纸过滤，取10 mL滤液加入等体积的10%三氯乙酸溶液混合均匀，室温静置30 min，2 500 r/min离心15 min，过滤，取10 mL滤液用凯氏定氮消化。PI计算公式[15]如下：

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel软件进行数据统计分析，用SPSS 19.0软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 酶添加量对剪切力的影响

图 1 干腌羊火腿风干过程中酶处理组和对照组剪切力的变化Fig. 1 Change in shear force of zingibain-treated and control groups during drying of dry-cured mutton ham

剪切力是测定肉嫩度的重要指标[16]；肉类的食用品质是由食用期间评估的嫩度、多汁性和风味决定的[17]。剪切力越大，则嫩度越低；剪切力越小，则嫩度越高[13]。由图1可知，随着风干时间的延长，干腌羊火腿剪切力总体呈上升趋势，各组在风干过程中的差异显著（P＜0.05）；是由于在风干期间羊火腿失水较多，导致其体积缩小，硬度和韧性逐渐增大，切割所需要的剪切力也较大。因此，随着加工期的延长，剪切力值呈逐渐增大的趋势；这与Monin等[18]的实验结果相符。而且不同添加量生姜蛋白酶处理组剪切力都明显低于对照组，并各组在风干阶段差异显著（P＜0.05）；当生姜蛋白酶添加量为0.05%时，干腌羊火腿30 d剪切力（2 898.82 g）比对照组（4 035.42 g）下降了28.17%；说明0.05%的生姜蛋白酶可明显降低干腌羊火腿的剪切力，并随之提高其嫩度；这是因为酶用量越大，反应速度越快，单位时间内酶对干腌羊火腿肌肉蛋白质降解程度越大，因此嫩化效果也很好[19]。经生姜蛋白酶处理的干腌羊火腿与未经处理的火腿剪切力值相差较大，说明生姜蛋白酶添加对干腌羊火腿剪切力的影响显著（P＜0.05）。

2.2 酶添加量对pH值的影响

图 2 干腌羊火腿风干过程中酶处理组和对照组pH值的变化Fig. 2 Change in pH value of zingibain-treated and control groups during drying of dry-cured mutton ham

pH值是评价肉质的基本参数，是决定火腿微生物稳定性的主要因素之一[20]。由图2可知，生姜蛋白酶处理组和对照组pH值整体来看呈上升趋势，各组在风干过程中的差异显著（P＜0.05）。0 d的pH值均为6.07，随着风干过程的延长，30 d对照组pH值上升为6.15，各阶段差异显著（P＜0.05）；这是由于在羊火腿风干成熟过程中，内源蛋白酶使蛋白质降解产生氨等碱性物质增多，使得pH值呈现逐渐升高趋势；本实验结果与郇延军等[21]对金华火腿加工过程中pH值的变化实验结果相一致。而生姜蛋白酶添加量为0.01%、0.03%和0.05%的处理组pH值分别上升为6.18、6.23和6.40，明显高于对照组，各组间差异显著（P＜0.05）；可知，随着生姜蛋白酶添加量的增加，pH值也随之升高；这可能是因为在风干成熟过程中，不同添加量的生姜蛋白酶使肌肉蛋白质发生不同程度的降解使碱性物质增多，从而使pH值呈上升趋势。

2.3 酶添加量对水分质量分数的影响

水分约占肉总量的70%～80%[22]，其含量和分布状态直接影响到肉与肉制品的色泽、嫩度、多汁性和风味等食用品质，同时对肉与肉制品的加工特性和贮藏品质有一定影响。

由图3可知，随着加工期的延长，不同添加量生姜蛋白酶处理组和对照组干腌羊火腿水分质量分数都呈下降趋势，并各组在风干阶段的差异显著（P＜0.05）；这与García[23]和Huang Yechuan[24]等的研究结果相似。当生姜蛋白酶添加量为0.01%和0.03%时，其水分质量分数与对照组水分质量分数从0 d的65.04%分别下降至30 d的40.19%、42.83%和46.96%，差异显著（P＜0.05）；而生姜蛋白酶添加量为0.05%时，水分质量分数在23 d下降至44.71%，这相当于其他3 组30 d的水分质量分数，说明生姜蛋白酶添加量为0.05%时，干腌羊火腿在23 d就达到对照组与其他两个添加量酶处理组30 d的水分质量分数。生姜蛋白酶降解肌肉蛋白质，使肌肉蛋白组织结构发生变化，并使其系水力下降，从而使水分含量逐渐减少[25]；并使干腌羊火腿的成熟时间缩短至23 d。

2.4 酶添加量对系水力的影响

肉制品的保水性（系水力）是肌肉保持水分的能力，对肉的嫩度与多汁性有重要的影响[26]；失水率是表示肉制品的保水性的重要指标[27]。

由图4可知，随着羊火腿风干成熟时间的延长，失水率呈下降趋势，且不同生姜蛋白酶处理组失水率较对照组高，且各组在各阶段差异显著（P＜0.05）；这与水分含量变化趋势相反。

由图5得知，在整个风干过程中，羊火腿系水力逐渐下降，并各组间差异显著（P＜0.05）这与羊火腿水分含量变化趋势一致；随着生姜蛋白酶对肌肉蛋白质的降解时间的延长，肌肉蛋白组织结构被破坏，从而使系水力下降[25]。

由图4和图5得知，随着风干过程的延长，干腌羊火腿的保水性逐渐下降，其水分含量与失水率呈负相关，水分含量越少，失水率越大；水分含量越大，则失水率越小。而与系水力呈正相关，水分含量越大，系水力越大；水分含量越少，则系水力越小[28]。

2.5 酶添加量对TBA值的影响

图 6 干腌羊火腿风干过程中酶处理组和对照组TBA值的变化Fig. 6 Change in TBA value in zingibain-treated and control groups during drying of dry-cured mutton ham

TBA值是以多不饱和脂肪酸氧化产物丙二醛为主体的醛类物质与硫代巴比妥酸反应在波长532 nm的吸光度；并且是检测脂肪氧化程度的一个重要指标[29]。由图6得知，随着风干过程的延长，干腌羊火腿TBA值呈上升趋势，各组在不同风干阶段差异显著（P＜0.05）；且0～8 d脂肪氧化程度明显比后面加工阶段快，这可能是因为在腌制期间肌肉吸收的食盐较多导致快速脂肪氧化。这与Kanner[30]和Ripollés等[31]的实验结果一致，研究表明，一定浓度的NaCl可以促进脂肪的氧化，而盐是在火腿腌制的过程中必不可少的，因此，即便不考虑外界因素的影响，火腿在腌制过程中也会发生一定程度的氧化反应。可知，对照组与添加量为0.01%、0.03%、0.05%的生姜蛋白酶处理组的TBA值从第0天的0.04 mg/kg分别增加为第30天的0.38、0.39、0.40、0.42 mg/kg，各组间差异显著（P＜0.05），0.05%生姜蛋白酶处理组第30天的TBA值是对照组的1.11 倍。生姜蛋白酶处理组TBA值明显高于对照组，这是因为注射生姜蛋白酶后，将干腌羊火腿在其最佳温度（50 ℃）保持1.5 h后，酶处理组受到高温影响，导致脂肪氧化较对照组高，但均在国家标准和国际认可的限量范围内（TBA值≤1 mg/kg）[32]。

2.6 酶添加量对TN质量分数的影响

图 7 干腌羊火腿风干过程中酶处理组和对照组TN含量的变化Fig. 7 Change in TN in zingibain-treated and control groups during drying of dry-cured mutton ham

由图7得知，TN质量分数总体呈上升趋势，并各组在风干过程中的差异显著（P＜0.05）。相比于其他阶段，3 d羊火腿TN质量分数下降，这是因为上盐过程中水溶性蛋白不断流失所引起的[33]；在后期加工过程中逐渐回升，这与王晶[34]与Buscailhon等[35]的研究结果一致。当生姜蛋白酶添加量为0.01%时，0 d的TN质量分数为2.80%（蛋白质质量分数为17.5%），30 d增加为3.62%（蛋白质质量分数为22.63%），这与对照组（3.59%）（蛋白质质量分数为22.44%）相比差异不大；而添加量为0.05%的羊火腿TN质量分数30 d增加至4.73%（蛋白质质量分数为29.56%），是对照组30 d的1.32 倍，差异显著（P＜0.05）。说明生姜蛋白酶添加量的增加可有效的影响羊火腿TN质量分数的变化。生姜蛋白酶可以通过降解肌肉蛋白质形成小肽，提高TN含量，从而使羊火腿变得更嫩，提高其食用品质。

2.7 酶添加量对NPN质量分数的影响

图 8 干腌羊火腿风干过程中酶处理组和对照组NPN含量的变化Fig. 8 Change in NPN in zingibain-treated and control groups during drying of dry-cured mutton ham

NPN质量分数指除蛋白质外的多肽、短肽及FAA等的总含量，这些物质的大量增加主要是由于肌肉中蛋白质发生了降解作用[36]。由图8得知，随着风干过程的延长，不同添加量生姜蛋白酶处理组和对照组都呈现上升趋势，且各组在各阶段差异显著。这是因为随着时间的延长，羊火腿中蛋白质发生降解成小肽和游离氨基酸，使非蛋白氮呈现逐渐增加趋势；这与Soriano等[37]对法国干腌火腿加工过程中含氮物进行研究也发现相似的结果。Martín等[38]对28 个火腿的理化成分变化规律进行分析，结果也发现：NPN、TN质量分数在整个加工阶段都持续上升。且不同添加量酶处理都高于对照组，各组间差异显著（P＜0.05）；0.05%生姜蛋白酶处理组羊火腿NPN质量分数最多，其对照（第0天）NPN质量分数为0.20%，第30天增加为0.99%，是对照组第30天（0.59%）的1.68 倍，第23天（0.87%）增加为对照组成熟期的1.48 倍，而添加量为0.01%和0.03%的生姜蛋白酶处理组第30天分别增加为0.62%和0.79%；说明随着生姜蛋白酶添加量的增加，蛋白质降解产生的FAA和多肽、短肽等的含量增加，从而导致NPN质量分数较对照组多[39]。

2.8 酶添加量对PI的影响

图 9 干腌羊火腿风干过程中酶处理组和对照组PI的变化Fig. 9 Change in PI in zingibain-treated and control groups during drying of dry-cured mutton ham

由图9可知，PI随着羊火腿风干过程的延长而逐渐上升，各阶段差异显著（P＜0.05）；0.01%、0.03%、0.05%生姜蛋白酶处理组和对照组（第0天）PI为7.18%，第30天PI分别上升为17.03%、18.57%、21.06%和16.30%，酶处理组蛋白质降解程度明显高于对照组，第30天时，0.05%的酶处理组较对照组增加了1.29 倍，第23天（19.69%）增加至对照组23 d（15%）的1.31 倍，各组间差异显著（P＜0.05）；说明不同添加量生姜蛋白酶的羊火腿的蛋白质发生不同程度降解，而且添加量越大，肌肉蛋白质降解程度越高。添加生姜蛋白酶虽然能加速蛋白质的降解，但酶解过程中要对蛋白质的降解程度进行严格控制。Careri等[40]通过对意大利Parma火腿中蛋白质降解的研究发现，PI在22%～30%时，对火腿的质地、风味有积极影响。因此，添加量为0.05%的生姜蛋白酶处理组PI接近此范围。

3 结 论

生姜蛋白酶对干腌羊火腿品质特性指标的影响显著。通过分析PI和其他品质指标发现，生姜蛋白酶最佳添加量为0.05%；在此添加量下，生姜蛋白酶促进干腌羊火腿肌肉蛋白质降解并破坏其组织结构，从而降低蛋白质的持水能力。因此，水分含量逐渐下降，而且添加0.05%生姜蛋白酶的处理组在风干后期（23 d）达到对照组成熟期（30 d）的水分含量，从而将其成熟期缩短为23 d。