HPLC-UV 法测定蝙蝠蛾拟青霉菌粉中腺苷的含量

赵雁冰 张艳华 杨恒 顾娅楠 张丽娟

(天津市康婷生物工程集团有限公司，天津 300385)

0 引言

腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷[1]，具有改善心脑血液循环、抑制中枢神经递质释放等活性[2]。在新冠肺炎时期，腺苷可作为先天免疫的介质在炎症和损伤的肺组织中高度分泌，通过腺苷受体A1、A2A、A2B、A3 的激活，在急性肺损伤的病理过程中起到抗炎、抑制免疫风暴产生、保护脏器损伤、修复重塑组织的作用[3]。因此，对蝙蝠娥拟青霉菌粉中腺苷的研究具有重要意义。

目前腺苷含量测定的检测手段层出不穷。本文采用了HPLC-UV 法测定腺苷含量，其检测方法操作简单、试剂毒性小、耗材少，检测成本较低。为腺苷含量的研究提供了检测依据。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

Waters Arc 液相色谱仪，配有紫外检测器；

电子天平(精度0.1mg 和精度0.01mg)；

超声波清洗仪。

1.2 试剂与材料

甲醇(色谱纯)；

乙腈(色谱纯)；

腺苷标准物质；

针式有机过滤膜，0.22µm。

1.3 标准储备液的配制

标准储备液(1.0mg·mL-1)精密称取腺苷标准品0.01g(精确至0.01mg)置于10mL 棕色容量瓶中，用5%甲醇溶液定容至刻度，于4℃冰箱中保存。

1.4 色谱条件

色谱柱：C18柱(250mm×4.6mm，粒径5.0μm)；

柱温：25℃；

流动相：乙腈∶水=5∶95；

流速：0.6mL·min-1；

检测波长：260nm；

进样量：10μL。

1.5 实验步骤

标准使用液配制：取适量1.3 标准储备液于10mL 的容量瓶中，用5%甲醇溶液定容至刻度，配制成浓度与样品中腺苷浓度相近的标准使用液。

样品处理：精密称取0.5g 待测试样于50mL 离心管中，精确加入10mL 5%甲醇溶液，常温下，超声提取20 min，过0.22µm有机滤膜，待测。

分别取标准使用液和样品提取液10μL，注入高效液相色谱仪，按照1.4 色谱条件检测。

2 结果与讨论

2.1 不同提取液的比较

本实验比较了90%甲醇溶液和5%甲醇溶液两种提取液，90%甲醇溶液作为提取液时，谱图上有很大的前沿峰，考虑溶剂效应影响。因此选用了5%甲醇溶液作为提取液，谱图中峰型较好，而且，选用5%甲醇溶液所用有机试剂较少，对人体伤害较小，成本较低。因此，最后选用5%甲醇溶液作为该方法的提取溶液。

2.2 超声提取时间的对比

称取约0.5g 试样5 份，超声提取时间分别是：10min、20min、30min、40min、50min，5 个提取时间测得的样品含量接近，为了充分提取，最后选择20min 为最佳的提取时间。

2.3 检测波长的选择

将腺苷标准溶液按照1.4.1 的色谱条件经二极管阵列检测器测试，3D 光谱图显示260nm 波长处腺苷有最大吸收。因此，260nm 作为该检测方法的最佳检测波长。

2.4 标准曲线、线性关系、检出限和定量限

标准曲线的绘制：临用前吸取一定体积的标准储备液，用5%甲醇溶液稀释成浓度分别为：5.08μg·mL-1、10.16μg·mL-1、20.32μg·mL-1、40.64μg·mL-1、60.96μg·mL-1、101.6μg·mL-1的标准系列溶液。分别取以上各浓度的标准系列溶液注入色谱仪，在1.4 色谱条件下测定，以浓度为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。其线性方程为y=55,124.01386x+7,648.57508，相关系数为0.999991，在浓度为5.08～101.6μg·mL-1范围内线性关系良好。

当称样量为0.5g,定容体积为10mL 时，以信噪比S/N=3 的浓度为检出限，检出限为0.17mg·kg-1，以3 倍的检出限对应的浓度为定量限，定量限为0.51mg·kg-1。

2.5 精密度和回收率

精密称取6 份待测样品测定精密度为0.8%，按试样中腺苷含量的80%、100%、120%为3 个添加水平，每个添加水平测试3个平行样品进行回收率实验。计算结果符合回收率验证的技术要求，结果见表1。

表1 蝙蝠蛾拟青霉菌粉中腺苷的加标回收率

2.6 实际样品检测

5 批蝙蝠蛾拟青霉菌粉样品，每批次分别称取两份样品，按照1.5.2 的实验步骤进行前期处理，按照1.4 的色谱条件测定峰面积，以外标法计算含量，检测结果均达到技术指标要求。

3 结语

样品经5%甲醇溶液超声提取，过0.22µm 的有机滤膜、经C18色谱柱分离，最后用HPLC-UV 检测器检测。该方法操作简单、准确、重复性好、回收率高。为含腺苷产品的方法研究和产品质量控制提供了参考方法。