龙胆苦苷对人上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响及机制

高天勤，李欣，董圣军，程春雷，史荣军，贾龙，王健，刘宝辉

(1滨州医学院附属医院，山东滨州256603；2滨州市人民医院；3山东省食品药品检验研究院；4阳信县人民医院)

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，病死率居妇科恶性肿瘤的首位[1]。化疗是目前治疗卵巢癌的主要方案，但卵巢癌对化疗药物的耐药及癌细胞较强的迁移能力是治疗中急需解决的难题。近年来，传统中药因来源广泛、不良反应少、应用安全及缺乏耐药性等优点越来越到关注。龙胆苦苷(GPS)是龙胆科龙胆属植物龙胆的主要有效成分，大量临床及实验研究发现，龙胆苦苷不仅有抗炎止痛[2]、保肝利胆[3]的作用，还具有拮抗肿瘤的作用[4]。但GPS对卵巢癌细胞增殖、迁移等的作用及机制尚未有报道。2018年1～5月，我们观察了GPS对人上皮性卵巢癌HO8910细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响，并探讨其机制，为GPS抗卵巢癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、材料及仪器 人上皮性卵巢癌HO8910细胞由滨州医学院中心实验室提供。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、噻唑蓝(MTT)购买于美国Sigma-Aldrich公司；鼠源抗鼠凋亡蛋白B细胞白血病淋巴瘤相关蛋白(Bax)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)、p-P38 MAPK、B淋巴细胞/白血病-2(Bcl-2)抗体及β-actin均购自美国Cell Signaling公司；原位末端转移酶标记(TUNEL)检测试剂盒购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔或鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；二喹啉甲酸(BCA)×100蛋白质定量测定试剂盒、组织裂解蛋白提取液、蛋白酶抑制剂购自上海碧云天生物技术公司；酶标仪购自美国Biotech公司；CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司；荧光显微镜购自日本Olympus公司；电泳、湿转移槽及Western blotting发光照相系统购自美国Rio-Red公司。

1.2 细胞分组及干预 人上皮性卵巢癌HO8910细胞用10%胎牛血清的DMEM细胞培养液，于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱内培养2～3 d。培养至细胞贴壁融合。加入0.25%胰蛋白酶进行消化并轻轻吹打将已贴壁的细胞，直至镜下观察细胞收缩至变圆，加入培养液以终止胰蛋白酶的作用。将脱落分离下的细胞吹打均匀后按1×108/L接种于培养板或培养瓶中。待细胞融合后，换用无血清的DMEM培养液培养4 h，使细胞同步化后将细胞随机分为对照组、GPS低剂量组、GPS中剂量组、GPS高剂量组。对照组单纯加入0.01% DMSO培养48 h；GPS低、中、高剂量组分别在加入10、20与40 μmol/L GPS的DMEM培养液中培养48 h，GPS用DMSO预溶，并用MEM培养液稀释至相应浓度。

1.3 各组细胞增殖能力观察 采用MTT法。待细胞干预结束后，弃细胞培养液，冲洗后加入DMEM培养液(100 μL)和含0.5%MTT的培养液(10 μL)，37 ℃无菌CO2培养箱内孵育4 h后，再次弃培养液，并加入100 μL的DMSO原液，振荡10 min后，用酶标仪计于490 nm波长处测定吸光度(A)值，并重复上述实验3次。增殖抑制率=[(对照组OD值-各组实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

1.4 各组细胞凋亡情况观察 采用TUNEL实验。各组细胞经4%的多聚甲醛固定1 h后，根据该实验试剂盒所述的双重染色法，TUNEL检测液可沾染到凋亡细胞的细胞核，镜下呈绿色，DAPI可沾染到所有凋亡和未凋亡的细胞核，镜下呈蓝色。每组细胞随即在荧光显微镜下选择5个视野并观察计数。细胞凋亡率=凋亡细胞/所有细胞×100%。

1.5 各组细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。实验步骤依据参考文献[5]。将混匀的血管内皮细胞以5×105/mL均匀种于6孔板内，并铺满整个孔板。各组给予上述相应处理后，以P200移液器枪头垂至于6孔板划出三条平行的“损伤”。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入5%胎牛血清培养基后，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养8 h。运用倒置相差显微镜对迁移的各组细胞进行拍照，并计算出划痕上下界限之间距离的平均值。对照组设定为100%，计算细胞迁移率。

1.6 各组细胞内p-P38 MAPK、凋亡相关蛋白表达检测 采用Western blotting法检测p-P38 MAPK、促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。待细胞干预结束后，弃细胞培养液，充分冲洗后加入细胞裂解液裂解细胞，收集细胞裂解物，对各组蛋白总量进定量。取20 μL总蛋白在1×十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲液中煮沸8 min。当蛋白充分变性充分后，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并电转移至硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜用含50 g/L脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h。然后依次滴加p-P38 MAPK、P38 MAPK、Bax、Bcl-2和β-actin抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜后TBST洗涤3次，每次10 min，然后用1∶5 000的辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗兔或鼠IgG孵育2 h，然后用TBST洗涤3次，最后用增强化学发光(ECL)发光液进行曝光显影，Bio-Rad照相系统进行照相并用其附带的软件分析蛋白的相对表达量。对照组设置为100%。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率、凋亡率及迁移率比较 与对照组相比，GPS中剂量组、GPS高剂量组细胞增殖抑制率、迁移率均降低，凋亡率均升高(P<0.05或0.01)；且GPS高剂量组细胞增殖抑制率、迁移率均低于GPS中剂量组，凋亡率高于GPS中剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率、凋亡率及迁移率比较

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01；与GPS中剂量组比较，#P<0.05。

2.2 各组细胞内Bax、Bcl-2及p-P38 MAPK蛋白表达比较 与对照组相比，GPS中剂量组、GPS高剂量组细胞内Bax、p-P38 MAPK表达上调，Bcl-2表达下调(P<0.05或0.01)，且GPS高剂量组细胞内Bax、p-P38 MAPK表达均高于GPS中剂量组，Bcl-2表达低于GPS中剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 各组细胞Bax、Bcl-2及p-P38 MAPK表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01；与GPS中剂量组比较，#P<0.05。

3 讨论

卵巢癌因其起病隐匿，缺乏早期诊疗指标，易早期出现浸润、转移及等原因，病死率位居妇科恶性肿瘤首位[1, 6]。虽然目前对卵巢癌的诊疗取得了一定的进展，但患者的5年病死率仍在25%～30%[7]。目前临床上用于治疗卵巢癌的药物不良反应大，且易产生耐药性[8]。因此，寻找新的对卵巢癌细胞敏感、且具有更少不良反应及耐药性的药物，是降低卵巢癌患者病死率、改善预后的关键。

GPS属于裂环环烯醚萜苷类化合物，是龙胆属植物的主要药效成分之一。除了有抗炎止痛[2]、保肝利胆[3]、保护心肌[9]等作用外，在最近的研究发现，从龙胆中分离获得的乙醇提取物具有抑制小鼠肉瘤、早幼粒细胞性白细胞及肺癌等多种肿瘤细胞的增殖作用[4,10]。赵忠伟等[11]研究发现，GPS能够肝癌细胞的增殖，其具体机制为使肝癌细胞的G0/G1细胞增多，改变肝癌细胞的周期，同时可以诱导肝癌细胞发生凋亡。但GPS对卵巢癌细胞增殖、迁移的影响尚未有报道。本研究发现，与对照组相比，GPS中剂量组、GPS高剂量组细胞增殖抑制率、迁移率均降低，凋亡率均升高，提示GPS可抑制人上皮性卵巢癌细胞的增殖及迁移，并促进其凋亡；GPS高剂量组细胞增殖抑制率、迁移率均低于GPS中剂量组，凋亡率高于GPS中剂量组，提示GPS较高时作用更明显。

P38 MAPK是细胞内MAPK之一，P38 MAPK信号通路在许多肿瘤组织中呈持续激活状态，肿瘤细胞中P38 MAPK可影响到下游细胞周期调节蛋白及凋亡相关蛋白等效应分子的活性[12]。P38 MAPK激活的性质决定P38 MAPK信号通路促进还是抑制细胞凋亡[13]。例如P38 MAPK可通过改变Bcl-2的构象使其抗凋亡活性降低，从而抑制Bax/Bcl-2二聚体的形成，诱导癌细胞凋亡[14]。本研究发现，与对照组相比，GPS中剂量组、GPS高剂量组细胞内p-P38 MAPK表达上调，且GPS高剂量组细胞内p-P38 MAPK表达高于GPS中剂量组，提示GPS可抑制人上皮性卵巢癌细胞的增殖及迁移，并促进其凋亡的作用可能与激活P38 MAPK信号通路，进而抑制Bax/Bcl-2等相关细胞凋亡途径而实现。

Bax是一种线粒体蛋白，位于细胞的胞质当中，通常以单体形式存在，当细胞过氧化损伤时Bax可以与线粒体膜相互结合形成复合体，促使凋亡因子从线粒体中释放出来，从而启动凋亡，加重组织损伤。Bcl-2属于一种抗凋亡蛋白，可以抑制凋亡因子的释放，从而减少超氧阴离子。同时Bcl-2还可以与Bax聚合，抑制Bcl-2从而抑制细胞凋亡[15]。本研究发现，与对照组相比，与对照组相比，GPS中剂量组、GPS高剂量组细胞内Bax表达上调，而Bcl-2表达下调，表明GPS可能通过Bax/Bcl-2信号通络导致细胞凋亡。

综上，GPS具有抑制人上皮性卵巢HO8910细胞增殖、迁移并促进其凋亡的作用，其作用机制可能通过P38 MAPK信号通路，进而上调凋亡蛋白Bax、下调抗凋亡蛋白Bcl-2，诱导HO8910细胞凋亡。但具体的作用机制需应用P38 MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580干预进一步证实。