大鼠肝癌细胞Mael、Ddx4 mRNA及蛋白的表达及意义

古丽米热·依米提，王延蛟，斯坎德尔·白克力

(新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐830011)

肝癌是世界上第5大常见恶性肿瘤，在我国排在恶性肿瘤第2位[1]。研究发现，Piwi-interacting RNA与Piwi蛋白相作用的RNA(piRNAs)在肝癌中异常表达，并在肝癌的发生发展中发挥重要作用[2]。Piwi/piRNAs通路基因蛋白质漩涡同系物基因(Mael)和生殖细胞特异性蛋白4(Ddx4)为候选癌基因，在多种恶性肿瘤细胞系中都有表达[3]。研究发现，Mael基因在乳腺癌细胞及乳腺癌组织中都存在高表达[4]。Ddx4是一种肿瘤干细胞标志物，也是细胞质蛋白、干细胞蛋白、生殖细胞特异性标志物，Ddx4的高表达与卵巢癌的发生有关[5]。近年研究发现，Piwi/piRNAs可能与肝癌的增殖、抗凋亡以及侵袭转移等发生发展密切相关[6]。2017～2018年，我们检测了大鼠肝癌CBRH-7919细胞中Mael和Ddx4基因mRNA转录及蛋白表达水平的变化，探讨Mael和Ddx4基因的表达水平在肝癌中的意义。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 大鼠肝癌CBRH-7919细胞、正常肝细胞BRL由中科院上海细胞库提供。RPMI1640液体培养基和胎牛血清、DEN(纯度99.9%)购自美国Sigma公司；Mael、Ddx4和GAPDH引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Mael、Ddx4和GAPDH兔抗鼠单克隆抗体购自Abcam公司；加强型组织/细胞RNA快速提取试剂盒购自聚合美生物公司；RNeasy Mini试剂盒、RT-PCR试剂盒均为Qiagen公司；蛋白裂解液购自美国Thermo公司；引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司根据设计合成。

1.2 细胞分组及培养 将大鼠肝癌细胞CBRH-7919作为肝癌细胞组，正常肝细胞BRL作为正常肝细胞组，均在无菌条件下加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，细胞在37 ℃、5%CO2的孵箱内进行培养。每次换液之前加入PBS，两次冲洗细胞，再用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液换液，均取对数期细胞进行检测。

1.3 Mael、Ddx4 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。两组细胞培养至对数期后，用TRIzol法提取细胞进行总RNA提取。取质量符合要求的RNA产物，逆转录得到cDNA。按SYBR Green Real-time PCR(TaKaRa) 试剂盒的操作步骤进行实时荧光定量qRT-PCR。Mael引物上游5′-GAGGATTTCGGTTCCATTGCC-3′，下游5′-TTTCTGATGCCCGCTCCATAC-3′，扩增片段189 bp；Ddx4引物上游5′-ACAGGATGTTCCTGCGTGG-3′，下游5′-TGTTCAGTGTGTTCTTGCCCT-3′，扩增片段192 bp；GAPDH引物上游5′-CAGGGCTGCCTTCTCTTGTG-3′，下游5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3，扩增片段171 bp。反应体系：25 μL反应体系含1 μL cDNA模板、12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM、1.6 μL上游引物、1.6 μL下游引物、10.3 μL dd H2O。PCR反应条件为：95 ℃起始变性3 min，随后95 ℃变性10 s，退火30 s(GAPDH退火温度60 ℃，Mael退火温度60 ℃，Ddx4退火温度58 ℃)共40个循环，延伸65～95 ℃ 10 s，40个循环。结果用2-ΔΔCt计算。

1.4 Mael、Ddx4蛋白表达检测 采用Western blotting法。将两组细胞加入1 mL裂解液，裂解20 min，于4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液；吸取加入200 μL BCA液，37 ℃水浴30 min，酶标仪测定562 nm处吸光值，根据标准曲线计算出蛋白浓度；取10 μg用以检测Mael、Ddx4以及内参GAPDH等蛋白质，一抗为兔抗鼠多克隆抗体(GAPDH按1∶1 000；Mael按1∶2 000；Ddx4按1∶500)，SDS-PAGE电泳，PVDF转膜，封闭，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜五次，HRP标记的(山羊抗兔1∶10 000)二抗孵育2 h，TBST洗膜五次，加入ECL化学发光试剂进行曝光。

2 结果

2.1 两组Mael、Ddx4 mRNA表达比较 肝癌细胞组Mael、Ddx4 mRNA表达均高于正常肝细胞组(P均<0.01)。见表1。

2.2 两组Mael、Ddx4蛋白表达比较 肝癌细胞组Mael、Ddx4蛋白表达均高于正常肝细胞组(P均<0.01)。见表1、图1。

表1 两组Mael、Ddx4 mRNA及蛋白表达比较

注：与正常肝细胞组相比，*P<0.01。

注：1为肝癌细胞组，2为正常肝细胞组。

3 讨论

肝癌是最常见的肿瘤之一，肝癌的病死率与发病率在恶性肿瘤中均较高[7]。肝癌发生发展是多因素协同的复杂过程[8]。目前，对癌症发生发展的研究主要集中在细胞信号转导、肿瘤相关基因的调控方面[9]。piRNAs在肝癌中异常表达，并在肝癌的发生发展中发挥重要作用。piRNAs的失调能够通过影响细胞的生长、凋亡迁移和侵袭等生物学过程，影响肝癌的发生和进展[10]。piRNAs在癌细胞中表达异常，与肿瘤的发生及扩散、疾病的预后等密切相关[11]。

Piwi/piRNA通路基因Mael和Ddx4为候选癌基因，在多种恶性肿瘤细胞系中都有表达[12]。Mael基因是癌基因，也是睾丸生殖细胞特异表达基因，在肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞和前列腺癌细胞中都有不同程度的表达[13]。研究发现，Mael在多种肿瘤细胞系中都有表达，在乳腺癌和肺癌中相对其他肿瘤细胞系高表达[14]。Ddx4是一种较为熟知的肿瘤干细胞标志物，研究发现Ddx4的高表达与卵巢癌的发生、发展密切相关[15]。本研究发现，肝癌细胞组Mael、Ddx4 mRNA及蛋白表达均高于正常肝细胞组，表明大鼠肝癌细胞中Mael、Ddx4基因和蛋白表达均明显增高，可能在肝癌发生及发展具有重要作用，可作为肝癌的一项新的分子标志物。

综上所述，大鼠肝癌细胞中Mael、Ddx4基因和蛋白表达均明显增高，Mael和Ddx4基因表达与肝癌发生发展有一定的关系。肝癌细胞中Mael和Ddx4基因表达水平变化有可能作为肝癌的检测及治疗的一种分子标志物。