糖尿病肾病小鼠肾组织与细胞中miR-92b表达及其对纤维化的影响

申永超，蔡胜艳，董天，庞晨，杨伟振

(牡丹江医学院红旗医院，黑龙江牡丹江157011)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病严重的微血管并发症之一。近年研究表明，微小RNA(microRNA,以下简称miRNA)与DN肾纤维化密切相关，如可促进纤维链接蛋白(FN)的表达[1,2]，但具体的miRNA仍不能完全被识别。有文献报道，miR-92b可通过磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路调节神经胶质瘤细胞和非小细胞肺癌细胞的增殖和凋亡[3]。而PI3K/Akt信号通路又是DN病变过程中一条重要的转导路径，调控着DN时的肾小管间质纤维化[4]。FN作为间质细胞的标志蛋白之一，在肾小管间质纤维过程中起着重要作用。目前，miR-92b是否通过PI3K/Akt信号通路调控FN的表达变化从而参与DN肾纤维化过程，尚未见文献报道。2017年6月～2018年5月，我们对DN小鼠及人肾小管上皮细胞中miR-92b的表达变化进行观察，并探讨其对FN的影响与机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 8周龄C57BL/6雄性小鼠12只，体质量20～25 g，购自上海斯莱克动物公司。肾小管上皮细胞株HK-2购自中国科学院上海细胞库；链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司；SYBR Green Master购自Roche公司；TRIzol和Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司；RPMI-1640细胞培养基购自Hyclone公司；胎牛血清及减血清培养基购自广州翔博生物技术有限技术公司；miR-92b引物、miR-92b mimics及miRNEG对照购自广州锐博生物科技有限公司；Taq酶、抗β-actin抗体、抗FN抗体、兔抗大鼠Akt、兔抗大鼠p-Akt单克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自Abcom公司；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自KaTaRa公司；BCA试剂盒购自Thermo公司；CO2培养箱(Thermo公司)；RT-PCR扩增仪(Bio-Rad公司)；三诺安稳血糖仪(长沙三诺生物传感技术股份有限公司)；9.4 T高磁场磁共振小动物成像仪(BruKer公司)。

1.2 DN小鼠肾组织miR-92b、PI3K/Akt信号通路相关蛋白及FN表达检测

1.2.1 DN模型制备 选取8周龄C57BL/6雄性小鼠12只，随机分为DN模型组(Dia组)和对照组(Con组)，每组6只，Dia组按70 mg/kg左下腹腔内一次性注射STZ溶液(临用前用 pH 4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)，分3次隔日注射；对照组注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，分3次隔日注射。8周后，连续3 d小鼠尾静脉采血测定随机血糖，Dia组小鼠血糖≥16.70 mmol/L，表明糖尿病模型建立成功。糖尿病模型建立5个月后，Dia组小鼠体质量明显降低，血糖和肾指数显著升高，尿液微量白蛋白(MAU)和尿N-乙酰-β-D 氨基葡萄糖甙(NAG)含量显著升高；行高磁场磁共振肾脏检查示肾脏T2WI压脂信号减低，肾皮质与髓质变薄、交界不清，肾盂变小(见图1)，表明肾脏发生病变，DN模型制备成功。

注：A为Con组；B为Dia组。

1.2.2 DN小鼠肾组织miR-92b表达检测 采用RT-PCR法。造模5个月时处死两组小鼠，提取肾组织RNA，检测RNA浓度及纯度，并将RNA合成cDNA。配制20 μL的RT- PCR混合反应体系：cDNA 2 μL，RT引物各0.8 μL，SYBR Green Mix荧光染料6.4 μL，无菌蒸馏水10 μL。反应条件为50 ℃升温2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s；60 ℃退火1 min；扩增至40个循环，以U6为内参。

1.2.3 DN小鼠肾组织PI3K/Akt信号通路相关蛋白及FN蛋白表达检测 采用Western blotting法检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白Akt、p-Akt和FN蛋白表达。小鼠肾组织蛋白质被RIPA裂解液裂解后，离心5 min，取上清至0.5 mL离心管中。蛋白浓度测定按照BCA试剂盒说明书进行，并进行蛋白样品处理。配置10%的SDS-PAGE，将上述150 μg蛋白质SDS-PAGE电泳，转膜，BSA封闭，加入一抗过夜，二抗室温孵育，洗膜。以β-Actin为内参,用ECL化学发光法检测目的蛋白的表达。

1.3 DN细胞miR-92b、PI3K/AKT信号通路相关蛋白及FN表达检测

1.3.1 细胞培养 人肾小管上皮细胞株HK-2正常传代，并维持在RPMI-1640培养基中(含有10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg /mL)，置于条件为饱和湿度、5%CO2、37 ℃的培养箱中培养。每3天用0.5%胰蛋白酶消化传代，待细胞长至培养瓶80%后分为3 组，每组4瓶，并以无血清培养基饥饿24 h。

1.3.2 高糖对细胞miR-92b表达影响的观察 HK-2细胞接种于培养瓶中，每组4瓶。高糖组(HG组)用25 mmol/L右旋葡萄糖刺激24 h；低糖组(LG组)用5 mmol/L右旋葡萄糖刺激24 h；高渗对照组(DG组)用25 mmol/L左旋葡萄糖刺激24 h，以作为高渗对照。24 h后收集细胞，冷藏于-80 ℃冰箱，采用RT-PCR法检测miR-92b表达，方法同1.2.2。

1.3.3 转染miR-92b对PI3K/Akt信号通路相关蛋白及FN表达影响的观察 将HK-2细胞随机分为DG组、HG组、HG+miR-92b mimics组(HG+miR-92b组)和HG+miRNEG组(HG+Neg组)。DG组用25 mmol/L左旋葡萄糖刺激24 h，HG组、HG+miR-92b组和HG+Neg组用25 mmol/L右旋葡萄糖刺激24 h。然后采用细胞瞬时转染技术，按照Lipofectamine 2000说明书，将miR-92b转染至HG+miR-92b组细胞中，将miRNEG对照转染至HG+Neg组细胞中，转染浓度为50 nmol/L。HG组、DG组不转染。转染24 h后收集细胞，采用Western blotting法检测Akt、p-Akt和FN蛋白表达，实验方法同1.2.3。

2 结果

2.1 各组小鼠肾组织miR-92b、p-Akt、Akt、FN蛋白表达比较 Con组、Dia组肾组织miR-92b蛋白表达量分别为0.035 37±0.005 51、0.021 30±0.002 92。与Con组相比，Dia组肾组织miR-92b表达量降低，p-Akt/Akt、FN/β-actin相对蛋白表达量升高(P<0.05)。见图2。

注：A为Western blotting法检测条带；B为p-Akt/Akt相对蛋白表达量；C为FN/β-actin的相对蛋白表达量。 *为与Con组比较，P<0.05。

2.2 各组细胞miR-92b、p-Akt、Akt、FN蛋白表达比较 LG组、HG组、DG组miR-92b蛋白表达分别为1.134 0±0.045 9、0.524 7±0.018 7、1.299 0±0.045 9，HG组细胞miR-92b表达低于LG组(P<0.001)。p-Akt/Akt、FN/β-actin相对蛋白表达量均升高(P均<0.05)。见图3。

注：A为Western blotting法检测条带；B为p-Akt/Akt相对蛋白表达量；C为FN/β-actin的相对蛋白表达量。 *为与Con组比较，P<0.05。

2.3 转染miR-92b对PI3K/AKT信号通路相关蛋白及FN表达的影响 与DG组相比，HG组p-Akt/Akt、FN/β-actin相对蛋白表达量升高；与HG组相比，HG+92b组p-Akt/Akt、FN/β-actin相对蛋白表达量均降低(P<0.001)。见图4。

3 讨论

注：A为Western blotting法检测条带；B为p-Akt/Akt相对蛋白表达量；C为FN/β-actin的相对蛋白表达量。 *为与HG组比较，P<0.05。

DN病因机制繁多，随着病情的发展，DN将导致慢性肾功能衰竭，引起终末期肾病。目前DN已是导致1型和2型糖尿病慢性肾功能衰竭的主要原因，约30%的糖尿病患者会患该并发症。目前，对于DN的病因和发病机制仍旧不清。miRNA是一类内源基因编码的长度为18～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，可通过与靶基因mRNA的3′端非编码区结合，抑制靶基因mRNA的翻译或促进mRNA的降解，从而快速和灵敏地参与基因的表达调控，发挥其生物学效应，在生长发育、细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤发生等过程中起着重要作用[5～7]。

目前，miRNA已成为研究DN的热点，随着对DN的分子致病机制深入研究，临床基因治疗DN的可能性越来越大，miR-92b或可能成为DN的诊断标志物和治疗靶点。大量与DN相关的miRNA也已经被发现，例如miR-215、miR-25、miR-377等。miR-92b是一种与肿瘤细胞转移和浸润相关的miRNA，在多种肿瘤中表达异常，如鼻咽癌、肝癌、骨肉瘤等[8～10]。同时，在炎症反应中，miR-92b可以抑制肠道细菌肽诱导的炎症反应[11]。但是，miR-92b在DN中的作用仍未见有报道。本研究发现，Dia组小鼠肾组织miR-92b 表达低于Con组，表明DN时miRNA-92b表达水平降低，miRNA-92b可能在DN致病过程发挥着重要调控作用；DN细胞体外实验结果示，HG组细胞中miR-92b的表达也低于LG组，进一步验证了这一观点。

PI3K/Akt信号通路在真核生物中广泛表达，在细胞生长、分化、增殖和生存中起重要作用。Li等[3]研究表明，miR-92b可通过PI3K/Akt信号通路调节神经胶质瘤细胞和非小细胞肺癌细胞的增殖和凋亡。而机体高血糖时部分miRNA也会激活PI3K/Akt信号通路，并在DN发生和发展过程中起着重要作用[12]。本研究结果显示，Dia组肾组织p-Akt/Akt相对蛋白表达量高于Con组，HG组细胞中p-Akt/Akt相对蛋白表达量也高于对照组LG组，提示DN时p-Akt表达水平升高。Akt作为PI3K的下游效应分子，p-Akt表达水平升高，表明DN时PI3K/Akt信号通路被激活。过表达miR-92b时，与HG组相比，，HG+92b组p-Akt/Akt相对蛋白表达量降低，即p-Akt表达水平降低，表明过表达miR-92b可显著抑制PI3K/Akt信号通路，miR-92b可通过PI3K/Akt信号通路对DN的发生和发展起调控作用。

肾间质纤维化是DN病变过程中的重要事件，主要表现为肾小管上皮细胞丢失和细胞外基质堆积，此病变过程中肾小管上皮细胞向间质细胞转化(EMT)起主导作用。FN作为间质细胞标志蛋白在肾小管EMT过程中起着重要作用。被激活的PI3K/Akt信号通路可通过上调FN基因的表达，导致FN在肾小管过度积累，从而促进肾小管EMT过程，加重DN时的肾纤维[13～15]。本研究发现，与Con组相比，Dia组小鼠肾组织中FN/β-actin相对蛋白表达量显著升高，说明DN时FN mRNA表达水平也升高，我们同样也在细胞实验中验证了这一观点，与LG组相比，HG组细胞中FN mRNA表达水平升高；过表达miR-92b时，与HG组相比，HG+92b组FN/β-actin相对蛋白表达量显著降低，说明miR-92b的过表达不仅可以抑制PI3K/Akt信号通路，也可以抑制FN mRNA的表达，因此考虑miR-92b可能通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制FN mRNA的表达。

综上所述，DN小鼠及细胞中miR-92b表达水平降低，PI3K/Akt信号通路被激活和FN mRNA表达水平升高，过表达miR-92b可抑制PI3K/Akt信号通路、降低FN mRNA表达，从而减轻DN纤维化。本研究仅在动物及细胞水平对miR-92b在DN中的作用机制进行了初步探索，对于miR-92b抑制DN纤维的具体机制还需进一步研究。