急性湿疹大鼠皮肤屏障功能变化及机制

葛一漫，胡一梅，马韬，张灵玲，雍江堰，张朝明

(1成都中医药大学附属医院，成都610075；2成都中医药大学)

人体皮肤直接与外界接触，在一定程度上可以阻止外部环境中不利因素的侵害，还可防止体内水分的丢失。皮肤屏障主要指角质层结构相关的屏障，角质层结构主要包含角质细胞及细胞间脂质。任何改变角质层结构蛋白功能、脂质正常代谢的因素都可能会导致皮肤屏障功能异常。本课题组前期研究发现，急性湿疹的发病及病情的转归与皮肤屏障功能是否完好密不可分。但急性湿疹疾病中皮肤屏障的异常究竟是破坏了角质细胞结构，还是脂质结构，或者二者兼有尚需进一步证明。2016年1月～2018年12月，本实验拟通过比较正常大鼠和急性湿疹大鼠皮肤病理改变，探讨急性湿疹大鼠发病与皮肤屏障异常的相关性。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂与仪器 SD大鼠20只，体质量(200±20)g，由成都达硕动物实验有限公司提供；2，4-二硝基氯苯(DNCB)(成都科龙化工试剂厂)；AF200皮肤表皮水分丧失测定仪(英国BIOX公司)；一抗PAR-2(北京博奥森生物技术有限公司)；二抗及相应试剂盒及阳性片(北京中山金桥生物有限公司)；Image-Pro Plus图像分析系统(Media Cybernetics公司)

1.2 动物分组及模型建立 采用随机数字表法，将20只大鼠按分层随机法分为正常组、模型组各10只。模型组大鼠腹部、右背部剃毛后，于腹部涂5% DNCB 30 μL进行首次致敏，第3、5、7天于右背部涂0.2% DNCB 50 μL进行抗原攻击。第9天观察大鼠造模区皮肤是否有急性湿疹症状，如皮肤上出现红斑、水肿、丘疹、丘疱疹、水疱、糜烂等湿疹样皮损表现，即为造模成功。

1.3 观察指标

1.3.1 皮肤组织经皮水分丢失量(TEWL) 采用AF200皮肤表皮水分丧失测定仪测量大鼠造模区皮肤组织3次，取平均值作为TEWL。

1.3.2 皮肤病理改变 采用断颈法处死大鼠，手术剪取两组大鼠右背部皮肤，放入固定液中。石蜡包埋并切片，采用HE染色法观察组织病理改变，并作病理损伤评分：0分为皮肤的表皮、真皮结构完好清楚，层次分明，未见变性、坏死、过度角化，未见棘层增厚，周围组织未见水肿及炎细胞，细胞浸润等病理性改变；1分为皮肤的表皮、真皮结构轻度破坏，层次稍不分明，偶见变性、坏死、轻度角化，偶见棘层增厚，周围组织偶见水肿及炎细胞，细胞呈灶性浸润等病理性改变；2分为皮肤的表皮、真皮结构中度破坏，层次不分明，可见变性、坏死、过度角化，可见棘层增厚，周围组织可见水肿及炎细胞，细胞呈弥漫性浸润等病理性改变；3分为皮肤的表皮、真皮结构重度破坏，层次不分明，明显可见变性、坏死、过度角化，棘层增厚，周围组织有水肿及炎细胞，细胞弥漫性浸润等病理性改变。

1.3.3 人类中间丝聚合蛋白(FLG)mRNA表达 采用RT-PCR法检测。用TRIzol法提取急性湿疹大鼠皮肤组织中的总RNA，并鉴定检测样本纯度。FLG上游引物5′-CGAGGTGACCTGCACCAATGAC-3′，下游引物3′-CTGCTCCACCTTCGGGCCGACCCAC-5′，扩增长度186 bp；β-actin上游引物 5′-TCTAGGCACGTGGCAAGGTGTG-3′，下游引物 5′-TCATGAGGTAGTTGCCGTCAGG-3′，扩增长度125 bp。根据RT-PCR试剂盒说明书进行PCR反应，使用System SDS Software软件计算循环阈值(Ct)，采用β-actin作为内参照基因，以2-ΔΔCt作为FLG mRNA的表达水平。

1.3.4 蛋白酶激活受体2(PAR-2)表达 采用免疫组化染色法检测。剪取大鼠右背部皮肤，放入固定液中，逐级乙醇固定，石蜡包埋并切片，采用免疫组化SP法检测PAR-2表达，加入一抗PAR-2、二抗及阳性片。显色复染封片，显微镜观察。以细胞质呈棕黄色或黄色表达为阳性判断标准，采用Image-Pro Plus图像分析系统半定量检测积分光密度(IOD)，表示PAR-2表达。

2 结果

2.1 两组皮肤外观比较 正常组皮肤光滑无异常，模型组右背部造模区皮肤出现肉眼可见糜烂、红肿、丘疹等急性湿疹症状。

2.2 两组皮肤组织TEWL比较 正常组、模型组皮肤TEWL分别为(2.35±0.18)、(11.36±1.66)g/(h·m2)，模型组TEWL高于正常组(P<0.01)。

2.3 两组皮肤病理改变 正常组大鼠皮肤组织结构清晰完整，未见任何炎症充血水肿病理性改变，见图1、2。模型组大鼠呈急性湿疹病理改变，如皮肤组织结构模糊、水肿、充血及炎细胞浸润等，见图3、4。正常组、模型组病理评分分别为0、(2.20±0.63)分，模型组病理评分高于正常组(P<0.01)。

注：A为正常组，×100；B为正常组，×400；C为模型组，×100；D为模型组，×400。

2.4 两组皮肤FLG mRNA比较 正常组、模型组FLG mRNA表达分别为6.2±0.68、0.79±0.19，模型组FLG mRNA表达低于正常组(P<0.01)。

2.5 两组皮肤组织PAR-2蛋白表达比较 正常组中PAR-2阳性物质染色颜色浅，分布少见。模型组中PAR-2阳性物质染色深，分布广泛。正常组、模型组PAR-2蛋白表达分别为0.153 4±0.002 2、0.170 8±0.011 5，模型组PAR-2蛋白表达高于正常组(P<0.01)。

3 讨论

急性湿疹是临床常见的表皮及真皮浅层的炎症性皮肤病，属于迟发型超敏反应。在早期或急性阶段，临床症状为红斑、丘疹和小水疱，严重时出现渗出及糜烂。组织病理多表现为皮肤的表皮、真皮结构有不同程度的破坏，层次不分明，可见变性、坏死、过度角化，棘层增厚，周围组织有水肿及炎细胞细胞弥漫性浸润等。急性湿疹发生的病因多样，目前认为皮肤屏障功能的障碍是急性湿疹发病的关键。皮肤屏障功能的正常运作主要靠其最外层的角质层细胞起“砖墙”的支架功能，其次其间的脂质起“泥浆”粘连作用。任何改变角质层结构蛋白功能、脂质正常代谢的因素都可能会导致皮肤屏障功能异常。前期研究发现，皮肤屏障功能异常是导致急性湿疹的发病的机制之一。但究竟是急性湿疹疾病中皮肤屏障的异常究竟是破坏了角质细胞结构，还是脂质结构，或者二者兼有尚需进一步证明。

DNCB多用于是设计经典的急性湿疹模型，一般多刺激小鼠耳廓皮肤[1]。但有研究发现，小鼠耳廓皮肤组织较薄，不能很好地模拟急性湿疹易发的躯干皮肤，故推荐使用大鼠背部替代小鼠耳廓[2]。大鼠背部皮肤实验可用面积大，更利于急性湿疹皮损模型的大体观察，如红肿、丘疹、丘疱疹、糜烂渗出等现象。本研究使用DNCB刺激大鼠背部皮肤，发现模型组大鼠DNCB刺激后，出现明显的急性湿疹症状和符合急性湿疹的病理学变化，这与我们的前期研究一致[3]，表明本实验成功造模急性湿疹大鼠。

研究发现，急性湿疹患者正常的皮肤屏障功能被破坏，最突出的现象是角质层含水量减少，TEWL增高[4]。TEWL反映从皮肤表面蒸发的水分，代表表皮的渗透性屏障状态，是评价皮肤功能的重要指标。研究发现，TEWL的增加与皮肤屏障功能障碍相关，而正常或减少的TEW可以作为是皮肤屏障完整或恢复的评价指标[5,6]。本研究发现，与正常组相比，模型组大鼠皮肤角质层明显增厚，真皮层炎细胞浸润增多，局部角质层出现缺损，同时TEWL显著增高，提示急性湿疹大鼠产生的机制之一可能是皮肤屏障功能破坏，角质层水分的丢失增多，可能与TEWL的增加有关。

维持皮肤组织正常的新陈代谢除需角质细胞外，也离不开角质层的细胞间脂质的参与。FLG由324个氨基酸构成，存在于角质细胞内，在FLG的辅助下，角蛋白中间丝可进一步转化为角蛋白纤维束[7]，即皮肤屏障中“砖块”的主要成分，角质细胞的支架结构。FLG基因是编码丝聚蛋白原的主要基因，急性湿疹患者可出现FLG活性降低，降低丝聚合蛋白的含量，从而阻碍角蛋白丝纤维束稳定结构的建立，并减少其角质化包膜中的生成，破坏其作为“砖墙”的支架作用[8,9]。丝聚蛋白的减少不仅会破坏其与角蛋白中间丝构成的角质细胞“骨架”的稳定性，同时还可导致其下游产物天然保湿因子的减少，造成皮肤干燥，最终导致皮肤屏障功能异常。本研究发现，模型组FLG基因表达低于正常组，提示模型组大鼠通过减少FLG基因表达，降低丝聚蛋白原的活性、降低丝聚合蛋白含量。

细胞间脂质是一类疏水性细胞间质，由表皮棘层细胞合成，包括神经酰胺、不饱和脂肪酸及胆固醇等成分。其合成需由细胞质内存在的板层膜结构释放催化，该结构即板层小体是一类特殊的细胞成分，内涵丰富的脂质合成前物质和酶类。随着表皮棘细胞的不断上行，中层板层小体移动致颗粒层可与细胞膜相互结合，进而再排除到细胞间隙。表皮棘细胞继续移行分化成复层板层膜结构，转化为角质层细胞；另一方面，被排出的脂质前体则在酶的催化下，水解为脂质成分[10]。蛋白酶激活受体(PARs)属于G蛋白偶联受体家族，其中PAR-2在人的皮肤上广泛表达。PAR-2信号系统的上游信号是激肽释放酶(KLKs)，而急性湿疹时KLKs呈过表达状态。PAR-2活化后，导致板层小体数量减少，抑制脂质转运，导致脂质的“泥浆”黏合作用降低，破坏皮肤屏障功能[11]。此外，PAR-2可激活NF-κB 的信号转导，介导炎症因子的释放，促进肥大细胞脱颗粒加重急性湿疹炎症反应，形成恶性循环[12,13]。急性湿疹发生时，PAR-2被激活，PAR-2可抑制角质层细胞内的板层小体的分泌，大量板层小体掩埋在角质细胞内难以释放，可引起细胞间脂质含量的减少，导致脂质的“泥浆”黏合作用降低，破坏皮肤屏障功能[9,10]。本研究发现，与正常组相比，模型组大鼠FLG基因表达降低，PAR-2含量却增加，提示模型组大鼠可通过增加PAR-2的表达，抑制板层小体的分泌，抑制脂质转运，破坏其间脂质的功能，导致皮肤屏障功能难以发挥其正常的作用，诱发大鼠产生急性湿疹。

综述所述，模型组大鼠发生急性湿疹的机制可能是通过降低FLG基因表达，并增加PAR-2含量，同时破坏角质细胞及其间脂质成分，从而增加TEWL，最终破坏正常的皮肤屏障功能。