肾盂尿液荧光原位杂交检测在肾盂上皮细胞癌诊断中的价值

陆勇，何雪峰，平季根

(苏州大学附属第一医院，江苏苏州215006)

肾盂恶性肿瘤占全部肾脏恶性肿瘤约7%～8%，其中90%为泌尿系统上皮来源。临床上，肾盂肿瘤的诊断主要依靠尿脱落细胞学和影像学检查，但是这些检查方法往往会延误肾盂肿瘤的早期诊断[1,2]。研究证实，对尿液进行荧光原位杂交(FISH)检测诊断膀胱上皮细胞癌的敏感性明显优于脱落细胞学，特异性与脱落细胞学检查相当[3～5]。近期研究发现，对尿液进行FISH检测诊断上尿路上皮细胞癌同样具有较高的敏感性和特异性；但是，由于尿液取材通常为晨尿，常存在尿液标本中细胞收集数量不足等因素，使FISH检测对于早期上尿路上皮肿瘤的诊断率仍不是十分理想[6～8]。因此，本研究采用经膀胱镜下输尿管置管后收集肾盂尿液进行FISH检测，并与常规收集晨尿标本检测的结果进行比较，评估经膀胱镜下输尿管置管后收集肾盂尿液行FISH检测对肾盂上皮细胞癌的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2009年10月～2016年12月在我院疑诊为肾盂占位的患者44例，男30例、女14例，年龄(67.0±1.2)岁。均行泌尿系统CT、逆行上尿路造影以及膀胱镜检查，排除膀胱肿瘤和输尿管肿瘤可能。排除肾功能不全以及泌尿系统感染的患者。患者均行活体组织病理快速检查，以组织病理学诊断作为确诊肾盂上皮细胞癌的金标准。同期，收集20名健康志愿者的晨尿行FISH检测，以建立正常人群的阈值。本研究经过医院伦理委员会批准并告知患者及志愿者，签署知情同意书。

1.2 尿液取材方法 所有患者在行膀胱镜检查前、健康志愿者在清晨，留取晨尿100 mL。然后对疑诊肾盂占位患者局麻，膀胱镜下从患侧输尿管开口插入F5输尿管导管至肾盂，留置F5输尿管导管，收集肾盂尿液共100 mL。所有尿液样本均在2 h内送检行FISH检测。

1.3 FISH检测方法 收集尿液中的细胞进行样本玻片制备及预处理，尿液标本置于两个50 mL离心管中经5次离心，去上清。离心过程中，依次加入胶原酶B(0.005 g/5 mL Hank′s BSS)，KCL低渗溶液，固定液(甲醇∶冰醋酸3∶1)，吹打悬浮细胞，将细胞滴于玻片上，56 ℃环境中老化玻片。RNaseA溶液处理完毕后，立即将玻片置于37 ℃胃蛋白酶溶液中，室温下于2×SSC(pH 7.0)溶液中漂洗玻片2次。将玻片依次置于-20 ℃预冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2 min脱水，自然干燥玻片。将标本、探针混合物置于(73±1)℃水浴箱中变性。玻片经梯度脱水，自然干燥后，与探针杂交。将10 μL变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域，置于预热的湿盒中，42 ℃保温箱中过夜杂交。玻片经洗涤后，置暗处自然干燥。将15 μL DAPI复染剂滴加于杂交区域位置，在荧光显微镜下选用合适的滤波片组观察玻片。

1.4 FISH结果分析与判定 所用的FISH探针包括两种组合，CSP3/CSP7和GLP P16/CSP17探针，探针位点分别为3p11.1-q11.1/7p11.1-q11.1和9p21/17p11.1-q11.1，正常情况荧光显微镜下均可见2红与2绿两种颜色信号。异常信号主要表现为：3、7、17号染色体主要表现为非整倍体扩增，即细胞核内出现多于2个信号的表现；p16位点表现为缺失，即细胞核内出现少于2个信号。观察正常人的100个不重叠的细胞核，计数3、7、17号染色体非整倍体改变数值和p16位点缺失的细胞数，并计算出异常细胞数所占百分比，根据公式[阈值=平均值(M)+3×标准差(SD)]计算出正常人的阈值。异常结果以100个细胞核内出现3、7、17号染色体非整倍体改变和p16位点缺失的细胞百分比大于阈值为标准，且出现2种及以上探针信号异常时可诊断为肾盂上皮细胞癌。计数由两名专业人员独立完成，结果一致方可认定，主要分析细胞核大、不典型、不规则的细胞。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。组间比较采用配对资料的χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理检查结果 经病理检查确诊肾盂上皮细胞癌35例，均行根治性肾输尿管全切术。术后病理结果示Tis期2例、Ta期15例、T1期13例、T2期5例；低级别尿路上皮癌26例，高级别尿路上皮癌9例；肿瘤直径0.8～2.2(1.7±0.2)cm。术后标本解剖发现，肿瘤大多体积较小，呈现乳头样或息肉样外观。肾脏或肾盂良性病变9例，包括肾盂炎性病变3例、肾盂血块(血块伴机化)1例、肾盂结石或钙化4例、肾盂输尿管淀粉样变性1例。见图1。

注：a为CT所见肾盂可疑占位(箭头所示)，增强信号不明显；b为静脉肾盂造影，右侧肾盂肾盏未见充盈缺损；c为术后肾盂肿瘤组织标本，呈息肉样外观(箭头所示)。

2.2 正常人尿液FISH检测结果 20例正常人的尿液FISH检测结果对应的3、7、17号染色体非整倍体改变和p16位点缺失的正常阈值分别为3.9%、2.1%、2.4%和1.2%。

2.3 疑诊肾盂占位患者的尿液FISH检测结果 对患者晨尿、肾盂尿液检测后，诊断肾盂上皮细胞癌分别为24、32例。

2.4 晨尿、肾盂尿液FISH检测对肾盂上皮细胞癌的诊断价值比较 晨尿FISH检测诊断肾盂上皮细胞癌的敏感性为68.6%(24/35)、特异性为77.8%(7/9)；肾盂尿液FISH检测诊断肾盂上皮细胞癌的敏感性为91.4%(32/35)、特异性为77.8%(7/9)，经膀胱镜输尿管导管收集肾盂尿液FISH检测诊断肾盂上皮癌的敏感性高于晨尿(χ2=4.6，P<0.05)。

2.5 假阳性分析 9例肾盂或肾脏良性病变患者中，出现FISH检测假阳性2例，其中1例为肾盂输尿管淀粉样变性、1例为泌尿系统炎症，均体现在3、7、17号染色体的非整倍体扩增，而未出现p16位点的缺失。9例患者经5～36个月的严密随访，未发现患泌尿系上皮肿瘤的证据。

3 讨论

肾盂上皮细胞癌是一种临床上较少见的疾病，仅占泌尿系统上皮肿瘤的5%[9]。目前，对于肾盂肿瘤的诊断主要依靠CT、静脉/逆行肾盂造影、脱落细胞学和输尿管镜检查。然而，对于体积较小的肾盂肿瘤，CT增强信号可能不明显，肾盂造影又无充盈缺损改变，影像学资料难以明确诊断，往往延误了疾病的治疗，导致肾盂肿瘤预后较差[1,10]。尿脱落细胞学检查对上尿路肿瘤的诊断意义并不大，其检出率只有37.5%～50.0%[11]。虽然通过输尿管镜检查，可以提高上尿路肿瘤的诊断率，但输尿管镜是一种有创诊断方法，可能会造成肾盂输尿管穿孔、出血、输尿管撕脱等较严重的并发症，并且发生在肾下盏的肿瘤，由于观察角度受限，往往会被漏诊，一些病变不明显、无法准确取到组织进行活检的病例也往往会被遗漏。因此，需要一种检出率高、创伤性较小的方法来提高肾盂肿瘤的诊断率。

近年来，由于FISH具有较高的诊断敏感性和特异性，已被广泛应用于膀胱上皮细胞癌的检测。由于膀胱和肾盂上皮属于同一组织来源，Zhang等[12]用高通量基因芯片技术研究了肾盂和膀胱上皮肿瘤的基因表达情况，发现这两种肿瘤在遗传背景上无明显差别，仅在信号通路上存在CLCA2(1p22.3)和GABRE(Xq28)两个基因位点的差异。这样，应用FISH检测上尿路上皮肿瘤就有了理论基础。近期，国外一些小样本量的研究发现，无创性留取尿液行FISH检查诊断上尿路上皮癌的敏感性为75%～87.5%，特异性为80%～95%[6,7]。然而，Johannes等[8]应用FISH检测67例上尿路肿瘤患者的尿液样本时，发现FISH的诊断敏感性只有56%，认为FISH对于上尿路肿瘤的诊断有限，原因可能是尿液中肿瘤细胞过少所致，并认为采取有创方法收集尿液，有可能提高FISH诊断的敏感性。Lodde等[13]应用免疫细胞化学试验检测上尿路上皮肿瘤时，采取输尿管置管留取尿液的方法，诊断敏感性从75%提高到91%。Mian等[14]对尿路上皮癌研究发现，通过输尿管置管留取尿液的方法，可以降低由于泌尿系统良性病变导致的诊断假阳性率。我们考虑由于膀胱尿液中的肿瘤细胞数量或浓度的不足，影响了FISH检测结果，而且对怀疑肾盂上皮细胞癌的患者行膀胱镜检查是必须的，故采用膀胱镜下输尿管置管后留取肾盂尿液，行FISH检测，可能成为肾盂上皮细胞癌诊断的一种较可靠并且创伤较小的方法。本研究率先在国内采用膀胱镜下输尿管导管置入后收集肾盂尿液，应用FISH检测了44例疑诊肾盂尿路上皮细胞癌患者的尿液样本，结果发现，对肾盂尿液进行FISH检测诊断肾盂上皮细胞癌的敏感性为91.4%，明显高于常规晨尿检测所得结果(68.6%)，表明通过输尿管置管留取肾盂尿液的方法，可以提高FISH检测肾盂上皮细胞癌的诊断敏感性。

对肾盂肿瘤的早期诊断和早期治疗是提高肾盂癌预后的关键，因而提高早期、低级别肾盂肿瘤诊断的准确性显得十分重要。本研究中，35例肾盂上皮细胞癌有30例为非肌层浸润性上皮癌，26例病理为低级别，这些肾盂肿瘤患者的影像学检查很难明确是否为肾盂尿路上皮癌，主要因为CT检查发现肾盂占位较小，病变组织增强信号不明显，而且静脉/逆行肾盂造影无明显充盈缺损，而输尿管留取尿液行FISH检测则诊断出32例、敏感性为91.4%，表明采用输尿管留取尿液行FISH检测，对早期肾盂上皮细胞癌的诊断具有较高的敏感性。

目前，对于FISH检测出现假阳性结果的研究较少，有学者认为，一些泌尿系统良性疾病包括结石、炎症等确实存在FISH假阳性结果，主要原因可能是有活性的浅表伞状细胞和精囊腺细胞出现多倍体扩增以及试剂厂家制定的标准阈值偏低有关，并认为根据细胞形态和患者病史综合考虑，可以降低FISH结果的假阳性率[15]。本研究中，FISH检测出现2例相同的假阳性结果，1例为肾盂输尿管淀粉样变性、1例为泌尿系统炎症，主要原因可能是根据正常人设定的阈值偏低所致，表明输尿管留取尿液行FISH检测并不能提高其检测的特异性，通过扩大泌尿系统良性疾病样本量，重新设定阈值，有望提高FISH检测的特异性。

综上，应用膀胱镜下输尿管置管获取肾盂尿液的方法，能显著提高FISH检测肾盂上皮细胞癌的敏感性，有可能成为早期诊断肾盂上皮细胞肿瘤的一种创伤较小的可靠方法。