吐根碱对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移、侵袭的影响及机制

李溪，朱晔，吴培洁，梁志伟，周迎春

(广州中医药大学第一附属医院，广州510405)

肿瘤的生长和转移与血管的生成密切相关[1]。一方面，新生血管为肿瘤组织提供生长所需的氧气和营养物质；另一方面，新生血管为肿瘤的转移提供通道[2]。血管生成过程主要包括内皮细胞活化、增殖、迁移、成管[3]。因此，通过阻断血管生成过程可能抑制肿瘤血管的形成，从而达到抑制肿瘤生长和转移的效果。吐根碱是一种用于治疗急性阿米巴病的临床药物，能抑制其蛋白质的形成[4]。然而，目前尚无相关报道揭示吐根碱对肿瘤血管新生的抑制作用及潜在作用机理。2018年3～11月，我们利用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)模拟肿瘤新生血管内皮细胞，探讨吐根碱对其增殖、迁移、侵袭和成管能力的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与材料 HUVECs购于美国公司 ATCC 中心。吐根碱购于Sigam公司；DMEM培养液、胎牛血清和胰蛋白酶购于美国Hyclone公司；Transwell小室和Matrigel购于美国Corning公司；细胞裂解液购于浙江碧云天公司；PBS缓冲液、BCA蛋白定量试剂盒购于北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司；青霉素、链霉、PVDF膜购于北京索莱宝科技有限公司；单克隆抗体购于Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 细胞培养、分组及干预方法 HUVECs用DMEM完全培养液(10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和链霉素)培养，培养温度37 ℃，CO2浓度5%。置于培养箱内培养24 h后换液，待细胞生长至贴壁状态，细胞融合接近90% 时传代。取对数生长期的细胞，随机分为阴性对照组、吐根碱低浓度组、吐根碱中浓度组、吐根碱高浓度组。阴性对照组加入细胞培养基，吐根碱低、中、高浓度组分别加入终浓度为10、20、40 nmol/L的吐根碱。每组设3个复孔。

1.3 细胞增殖能力检测 采用MTS法。取对数生长期的HUVECs，制备成细胞密度为0.3×105/mL的悬液，每孔100 μL接种于96孔板中，同时每组设3个复孔。各组干预72 h，每孔加入20 μL的CellTiter 96 AQueous One Solution，继续培养4 h，然后用全自动酶标仪在波长490 nm下检测OD值，计算细胞相对存活率=(各浓度组OD值/阴性对照组OD值)×100%。

1.4 细胞迁移能力检测 ①采用细胞划痕实验。取对数生长期的HUVECs，在预先用0.1%明胶包被的12孔板中每孔接种5 000个细胞。待细胞贴壁并长到90% 以上时，用灭菌的10 μL枪头在孔中央划十字交叉线。用PBS清洗划掉的细胞。用不完全的DMEM饥饿细胞6 h之后弃掉培养基，阴性对照组中加不完全DMEM培养，低、中、高浓度药物组在完全DMEM培养基中培养。置于培养箱中8 h后，用PBS洗两次，加入2 μmol/L的calcein-AM处理细胞30 min，于倒置显微镜下观察，计算细胞迁移率=(各浓度组细胞迁移数/阴性对照组细胞迁移数)×100%。②采用Transwell小室迁移实验。将Transwell小室置于0.1%明胶包被的24孔板中，在培养箱中放置30 min以上。制备浓度为5×105/mL的HUVECs悬液，取200 μL置于EP管中，加入低、中、高浓度的药物并放在培养箱中处理1 h。将细胞悬液接种到小室内，下层加入 600 μL完全DMEM培养基置于培养箱中 8 h， 4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍，最后用结晶紫染色30 min，倒置显微镜下拍照，计算细胞迁移率=(各浓度组细胞迁移数/阴性对照组细胞迁移数)×100%。

1.5 HUVECs形成管腔数量检测 采用细胞成管实验。每孔加80 μL的Matrigel于48孔板中，放在细胞培养箱中30 min。制备细胞密度为5×105/mL的HUVECs悬液，取300 μL置于EP管中，加入低、中、高浓度的药物后放在培养箱中1 h。待Matrigel凝固后，将预处理的细胞悬液接到Matrigel上，放在培养箱中培养6 h。加入2 μmol/L的calcein-AM处理细胞30 min，于倒置显微镜下观察并拍照，计数形成的管腔数量(成管数)。

1.6 NF-κB信号通路p65蛋白表达检测 采用Western blotting法。用PBS洗两遍HUVECs后，在每皿中分别加RIPA混合裂解液(含各种磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂)。4 ℃，10 000 r/min离心20 min，收集上清液，用BCA定量试剂盒测蛋白浓度，均冰上操作。蛋白加入上样缓冲液，高温变性后加样，用10%分离胶和5%浓缩胶进行跑胶，转膜、封闭 ，加入一抗，4 ℃孵育过夜，PBST洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的IgG室温下孵育1 h，PBST洗3次，用化学发光法曝光显影，用Image J软件进行NF-κB细胞信号通路p65和磷酸化p65蛋白灰度值分析。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 阴性对照组细胞存活率为100%，吐根碱低、中、高浓度组细胞存活率分别为82.22%±0.32%、70.31%±0.58%、38.54%±0.46%，吐根碱低、中、高浓度组细胞存活率均低于对照组，且吐根碱中、高浓度组均低于吐根碱低浓度组，吐根碱高浓度组低于吐根碱中浓度组(P均<0.05)。

2.2 各组细胞迁移能力比较 划痕实验显示，吐根碱低、中、高浓度组的细胞迁移率均低于阴性对照组，且吐根碱高浓度组低于低、中浓度组，中浓度组低于低浓度组(P均<0.05)。Transwell小室实验显示，吐根碱低、中、高浓度组细胞迁移率均低于阴性对照组，且吐根碱高浓度组低于低、中浓度组，中浓度组低于低浓度组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞迁移率比较

注：与阴性对照组比较，*P<0.05；与吐根碱低浓度组比较，﹟P<0.05；与吐根碱中浓度组比较，△P<0.05。

2.3 各组成管数比较 阴性对照组、吐根碱低、中、高浓度组成管数分别为(38±2)、(30±2)、(20±3)、(5±1)个，吐根碱低、中、高浓度组成管数均少于阴性对照组，且吐根碱高浓度组少于中、低浓度组，中浓度组少于低浓度组(P均<0.05)。

2.4 各组NF-κB p65及磷酸化p65蛋白表达比较 吐根碱低、中、高浓度组NF-κB磷酸化p65蛋白表达均低于阴性对照组，且吐根碱高浓度组低于低、中浓度组(P均<0.05)；低、中浓度组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组NF-κB p65蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3 讨论

恶性肿瘤作为一类严重危害人类健康的疾病，是全球疾病致死的重要原因之一，全世界每年约有500万人死于恶性肿瘤。其中，肝癌的发病率占第五位，病死率占第三位[5]。肝癌的预后普遍较差，而且多数发生在术后2年，并伴随新的肿瘤产生[6]。肝癌发生发展较快，容易侵袭或转移，主要是依赖于血管的生成。因此，抑制肿瘤血管生成成为治疗肿瘤的重要策略之一[7]。目前FDA批准用于治疗肝癌惟一的靶向药物是抗血管新生抑制剂索拉非尼，但其药效并不令人满意，且不良反应大，如可引起严重的手足综合征、腹泻、皮疹等[8]，而且治疗费用昂贵。因此亟需要寻找安全、有效的抗肿瘤血管生成药物用于肝癌的治疗。

表2 各组NF-κB p65及磷酸化p65蛋白表达 比较

注：与阴性对照组比较，*P<0.05；与吐根碱高浓度组比较，﹟P<0.05。

新药的研发不仅耗费大量的人力和资金，而且新药研发周期长。诺贝尔得主詹姆斯·布莱克也曾说，“最有成效的药物研发是从老药开始”。例如具有解热镇痛作用的阿司匹林，由于其具有抗血小板聚集作用，又被人们用于预防血栓的形成[9]。因此，我们着眼于挖掘上市药物或临床在研药物的抗血管生成新用途。前期研究中，我们通过HUVECs细胞增殖实验筛选了1 200个FDA批准的药物，同时结合内皮细胞分化和迁移功能实验，初步发现了治疗急性阿米巴病的药物吐根碱具有潜在的抗血管新生功能。吐根碱是一种异喹啉型生物碱，存在于巴西产吐根的根中。临床上长期被用做治疗急性阿米巴病[4]。有研究发现，吐根碱可下调髓细胞白血病序列1重组蛋白(Mcl-1)蛋白从而引起肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRIAL)介导的凋亡[10]。除此之外，苏宏领等[11]研究发现，吐根碱可通过抑制PI3K-Akt信号通路活性，对肾癌具有显著的抑制作用。然而，目前尚无相关报道揭示吐根碱对内皮细胞的抑制作用及潜在作用机理。

在本研究中，我们评价了吐根碱对HUVECs多个功能的抑制效果，从而探讨其可能的作用机制。本研究发现，吐根碱低、中、高浓度组细胞存活率均低于对照组，且吐根碱中、高浓度组均低于吐根碱低浓度组，吐根碱高浓度组低于吐根碱中浓度组，表明吐根碱能够抑制HUVECs的增殖。基于以上结果，我们推测吐根碱的作用靶标可能是血管内皮细胞。

内皮细胞的迁移是血管生成中一个非常重要的过程，而肿瘤的生长和转移离不开血管新生。因此我们分别用划痕实验和Transwell迁移实验检测吐根碱对HUVECs迁移和侵袭的影响。本研究采用划痕实验及Transwell小室实验均显示，吐根碱低、中、高浓度组的细胞迁移率均低于阴性对照组，且吐根碱高浓度组低于低、中浓度组，中浓度组低于低浓度组，表明吐根碱能抑制HUVECs的侵袭和迁移，并且在一定范围内，吐根碱对内皮细胞的抑制浓度呈梯度依赖性，随着药物浓度的提高，对迁移的抑制效果不断增强。

血管生成是一个非常复杂的过程，内皮细胞的管状结构的形成是其中的一个关键步骤。本研究采用体外小管形成实验发现，吐根碱低、中、高浓度组成管数均少于阴性对照组，且吐根碱高浓度组少于中、低浓度组，中浓度组少于低浓度组，提示吐根碱能干扰HUVEC形成管腔结构，从而阻碍肿瘤血管的生成，减少养分供给。

NF-κB信号通路是一条控制着很多生理活动的信号通路，参与细胞生长、分化、生存、凋亡、迁移、血管生成等众多生理功能[12]。在NF-κB信号通路中，磷酸化的p65起着主要的调节作用[13]。NF-κB p65第536位丝氨酸位点磷酸化(磷酸化的p65 Ser536) 蛋白在胃癌中的表达降低，其表达与胃癌的分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关，并且磷酸化的p65 Ser536可能抑制胃癌细胞的迁移与侵袭能力[14]。欧志涛等[15]认为，细胞因子诱导的凋亡抑制分子1 能促进HepG2细胞增殖，与磷酸化的 p65表达量增多有关。本研究发现，吐根碱低、中、高浓度组NF-κB磷酸化p65蛋白表达均低于阴性对照组，且吐根碱高浓度组低于低、中浓度组，提示吐根碱能够下调NF-κB磷酸化p65的表达，从而抑制HUVECs的增殖、侵袭、迁移和形成管腔结构。

综上所述，吐根碱能抑制HUVECs的增殖、侵袭、迁移及形成管腔能力，其作用机制可能与下调NF-κB p65的磷酸化有关。