miR-182靶向调控FOXO3a表达对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响

余振兴，邓 磊，张先斌， 胡祖力，祝新根， 吴淼经

神经胶质瘤亦被称为胶质细胞瘤，是颅内最常见的恶性肿瘤之一，约占颅脑肿瘤的50%。按照肿瘤的起源可分为：星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤及少突胶质细胞瘤[1]。由于胶质瘤细胞所处特殊位置，药物治疗疗效差、手术难度大、易转移、复发[2]。小分子RNA-182(microRNA，miR-182)为编码区序列，通过调控下游基因的转录而影响相关蛋白的表达，影响细胞的增殖、凋亡和分化[3]。研究[4]显示，miR-182在癌细胞组织中高表达。“叉头蛋白”的O亚家族(forkhead, FOXO3a)是由FOXO3基因编码的一类蛋白质，FOXO3a蛋白在肝癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、淋巴瘤、白血病等多种恶性肿瘤细胞中均有表达[5]。该研究通过对胶质瘤U251细胞系中miR-182与FOXO3a的相互作用关系，探讨miR-182通过对FOXO3a蛋白的调控对胶质瘤细胞的增殖与侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器胶质瘤细胞U251购自上海中科院细胞所；DMEM高糖培养基、胰酶及脂质体Lipofectamine2000均购自美国Invitrogen公司；胎牛血清及双抗(100 U/ml青霉素与100 g/L链霉素组成)购自美国Gibco公司；FOXO3a一抗(兔抗)购自美国Cell Signaling公司；FOXO3a二抗(羊抗兔)购自北京康为世纪公司；β-action内参购自德国Tiangen公司；BCA蛋白浓度试剂盒、PCR扩增仪购自购自美国Thermo公司；miR-182与抑制剂及逆转录试剂盒购自美国ABI公司；荧光素酶基因检测试剂盒购自美国Promega公司；低温离心机购自德国Eppendoff公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 细胞培养与转染向U251细胞与正常人星型细胞分别加入含10%胎牛血清与1%双抗的DMEM高糖培养基溶液，制成悬液，放入培养箱(37 ℃、5% CO2)中培养。待细胞生长至对数期，加入胰酶进行消化，获得U251细胞悬液，按照分组分别加入对照组、无义序列miR-182、miR-182 micmics已整合成功的脂质体，完成细胞转染，继续培养约48 h直至转染成功后的细胞进入对数期。

1.3 构建FOXO3a质粒使用pc DNA3作为空载体质粒，报告强化绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)质粒载体，分别将野生型(亦称无干扰型)FOXO3a 3′-非翻译区(untranslated region, UTR)与突变型(亦称过表达型)FOXO3a 3′-UTR序列复制后导入pc DNA3载体，得到无干扰型与过表达型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR质粒。

1.4 进行荧光素酶报告实验将长满瓶底约80%的U251细胞消化后接种于96孔板，正常培养过夜，显微镜下观察，细胞密度超过75%时分别加入：A组突变型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR质粒；B组共转染突变型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR质粒和无义序列；C组共转染突变型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR质粒和miR-182 mimics；D组野生型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR质粒；E组共转染野生型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR质粒和无义序列；F组共转染野生型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR质粒和miR-182 mimics。待质粒与脂质体转染成功后，按照荧光素酶试剂盒操作，测定对应荧光素酶活性。

1.5 Western blot检测FOXO3a蛋白表达收集转染成功后不同处理的U251细胞，得细胞悬液，PBS清洗3次，取下层细胞，加入蛋白裂解液(PMSF与 RIPA按照1 ∶100)提取蛋白；4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集蛋白沉淀；BCA试剂盒测定标准蛋白曲线；按照实验流程配制好分离胶与浓缩胶，依次加入样品，设定电压80 V/120 V；待溴酚蓝出现在胶底附近时，电泳结束；按照胶块、PVDF膜处于正中间，两边依次为三层滤纸、海绵的顺序放置好，进行转膜，持续时间为90 min；使用TBST溶液洗脱3次，边洗边振摇，每次10 min；5%脱脂牛奶封闭结束后，孵育对应1抗过夜，继续TBST洗膜3次，每次10 min，加入对应辣根过氧化物标记的二抗，孵育1 h；选用ECL显影液显影结束后，应用Image J软件进行灰度分析。

1.6 qRT-PCR测定FOXO3a mRNA表达采用TRIzol裂解液快速提取不同处理细胞中mRNA，加入TRIzol溶液与氯仿(5 ∶1)混合液，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，得到3个相层；轻轻吸取上层无色含RNA水层，加入等体积异丙醇混匀，离心，保留下层沉淀；加入TRIzol溶液与75%乙醇混合液(1 ∶1)，对RNA继续清洗以去除杂质，离心，得到纯度更高的RNA提取物；将EP管倒扣于吸水纸上进行干燥，加入无RNase的水，混合均匀后备用。依次加入2 μl 10×RT工作液、4 μl 25 mmol/L MgCl2、2 μl 0.1 mol/L DTT、1 μl RNaseOUT(40 U/μl)、1 μl SuperScript RT(200 U/μl)合成引物序列，按照预变性95 ℃、10 min；变性95 ℃、15 s；退火56 ℃、60 s；延伸72 ℃、32 s程序设置PCR扩增。选用GAPDH作为内参。引物序列见表1。

表1 基因GADPH、FOXO3a引物序列

1.7 MTT法测定细胞增殖将正常U251细胞与转染siRNA-miR-182、miR-182 mimics及过表达FOXO3a成功的细胞进行培养，48 h后收集细胞，制备细胞悬液，按照3 000～8 000个/孔进行96孔板点板，每种设6个复孔；培养箱继续培养1～5 d后，每孔加入20 μl MTT溶液，继续培养4 h，加入100 ml DMSO，摇床低速振荡10 min，酶标仪490 nm处测定吸光度值。

1.8 Transwell法测定细胞侵袭能力将转染不同处理的细胞分别接种于Transwell上室(有/无Metrigel胶)，下室为含10%胎牛血清的完全培养液，培养36 h后，苏木精染色封片，测定穿过孔的细胞数目。

2 结果

2.1 MTT法测定转染miR-182对U251增殖能力的影响培养第1天，各组转染后的U251细胞增殖数量差异无统计学意义(P>0.05)；培养第2～3天，与对照组及无义序列组比较，转染miR-182 mimics组细胞数显著增加(P<0.01)；第3～5天，miR-182 mimics组细胞数虽有减小，但与对照组及无义序列组比较，其细胞数量仍呈显著性增加(P<0.05)。第1～5天，无义序列组U251细胞，细胞数量开始呈增加趋势后逐渐减少；与对照组细胞数比较，无义序列组细胞数无显著变化(P>0.05)。见图1。

2.2 Transwell法测定转染miR-182对U251侵袭能力的影响3组间穿过小室的细胞数差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，miR-182 mimics组穿过小室细胞数显著增多(t=5.577,P=0.005)。见表2、图2。

图1 MTT法测定转染miR-182 U251细胞的增殖能力

组别细胞数对照36.9±3.4无义序列34.6±2.7miR-182 mimics54.3±4.2F值6.551P值<0.05

图2 Transwell法测定转染miR-182对U251侵袭能力的影响×100

2.3 荧光素酶活性验证结果经Microma/miRBase/TargetScan靶基因数据库筛选，将FOXO3a暂定为miR-182调控的下游靶基因。经荧光素酶报告实验验证，A ～E组荧光素酶对应活性，见图3；两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)，miR-182 mimics与pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR共转染组(C组)荧光素酶活性明显较其他组低(P<0.01)，证实miR-182可抑制突变型质粒的荧光素酶活性，FOXO3a是miR-182调控的直接作用靶点。

图3 荧光素酶活性验证结果

A组：突变型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR质粒； B组：共转染突变型pc DNA3/ EGFP -FOXO3a 3′-UTR质粒和无义序列； C组：共转染突变型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR质粒和miR-182 mimics； D组：野生型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR质粒； E组：共转染野生型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR质粒和无义序列； F组：共转染野生型pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR质粒和miR-182 mimics；与A组比较：**P<0.01

2.4 转染miR-182后U251细胞内FOXO3a的蛋白表达情况Western blot 检测FOXO3a蛋白的表达，3组之间差异有统计学意义(F=13.128，P<0.05)；与对照组比较，miR-182 mimics组FOXO3a蛋白含量显著降低(P<0.05)。在qRT-PCR实验中，3组之间差异有统计学意义(F=17.227，P<0.05)；与对照组比较，miR-182 mimics组FOXO3a mRNA含量显著降低(P<0.05)。见图4。

2.5 突变型FOXO3a干扰U251细胞增殖与迁移变化与野生型FOXO3a干扰U251细胞组比较，MTT实验测定第1～3天，突变型组细胞数显著增加(P<0.05)；第4～5天，突变型组细胞数有减小趋势，与野生型组比较，其细胞数仍显著偏多(P<0.05)。在Transwell小室实验中，培养36 h后，与野生型组穿过细胞数(37.8±2.8个)比较，突变型组穿过小室的细胞数(25.2±2.64个)显著减少(P<0.05)。见图5。

3 讨论

胶质瘤是中枢神经系统细胞异常增殖与转移引起的恶性肿瘤之一，约占中枢神经系统肿瘤的3/5[6]。胶质瘤细胞极易向周围浸润，导致胶质瘤手术切除难度大，术后易出现复发；尽管随着现代科学技术的进步，胶质瘤患者的5年生存率仍然低至5%[7]。生命体的正常生长发育得益于基因精准的、多方位的整体调控。无论是基因本身的碱基序列发生微小改变，还是非编码区的调控序列发生异常，都会使机体的生理活动发生异常，这种异常超出机体的自我调节承受范围，即出现病理状态。miRNAs是一类自身无法直接表达蛋白质、可对下游基因蛋白质表达进行调控的小分子密码子[8]。有研究[9]者提出，下游靶mRNA的3′UTR为调控miRNA的主要结合位点。如miRNA-663可通过调控下游靶基因转移生长因子-β抑制胶质瘤细胞的增殖、转移与侵袭；miRNA-506可调控下游靶基因胰岛素样生长因子2 mRNA的结合蛋白1抑制胶质瘤细胞的增殖[10-11]。miR-182为miR-183-96-182家族一员，位于人类第7号染色体，被证实为具有癌基因功能。在多种胶质瘤细胞信号通路中均显示miR-182扮演着重要角色，Feng et al[12]证实miR-182过表达可调控神经突起生长素(neuritin，NRN1)基因与NRN1蛋白表达从而控制胶质瘤细胞的增殖与转移；Xue et al[13]等证实miR-182-5p的促进与抑制均可激活信号转导转录激活因子3信号通路，从而调控胶质母细胞瘤的增殖与迁移。本研究中，对对照组、无义序列组、miR-182 mimics组的U251细胞进行培养后显示，与其他两组比较，转染miR-182 mimics组的U251细胞增殖速度明显加快，提示miR-182可促进胶质瘤U251细胞的生长；在进行Transwell小室实验显示，转染miR-182 mimics组的U251细胞穿过小室的细胞数明显较其他两组多，提示miR-182可促进胶质瘤U251细胞的转移；经荧光素酶活性实验验证，miR-182 mimics与pc DNA3/ EGFP-FOXO3a 3′-UTR共转染组(C组)荧光素酶活性明显较其他组低，证实FOXO3a是miR-182调控的直接作用靶点。

图4 转染miR-182后U251细胞内FOXO3a的

图5 突变型FOXO3a干扰U251细胞增殖与迁移变化与野生型组比较：*P<0.05

FOXO3a是分子量为75 ku的蛋白质，含有高度保守的翼螺旋结构域，可被磷酸化或乙酰化激活。FOXO3a蛋白已被证实在受到蛋白激酶B与核因子κB激酶β的抑制剂等修饰激活后，其活性发生改变，可参与肿瘤细胞的生长与增殖。p53是一种重要的抑癌基因，当受到外界刺激时，FOXO3a与p53可相互促进以抑制肿瘤细胞的生长，且被证实二者为协同作用[14]。为近一步探讨miR-182对FOXO3a调控趋势，本研究选用脂质体进行转染，使FOXO3a进入突变状态，在体内过表达，结果显示：与对照组比较，进入FOXO3a蛋白突变状态的U251细胞增殖速度与侵袭速度均显著减小，突变状态U251细胞中miR-182的mRNA含量显著减小。