褪黑素与膝骨关节炎关节结构及血清标志物的相关性研究

常冰茹，徐建华，王 康，吴 娟，阮光峰，任家乐，卞福勤，丁长海,2

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是导致关节疼痛和残疾的常见疾病之一，以关节结构改变为主要特征，主要表现为关节软骨破坏、骨赘形成、软骨下骨髓损害等。OA的已知危险因素包括肥胖、增龄和慢性炎症等，但其发病机制尚未阐明，故深入研究OA的发病机制尤为重要。

褪黑素(melatonin，MT)是一种主要由哺乳动物松果体产生的内源性吲哚类神经激素，淋巴细胞、巨核细胞、骨髓、肝脏、胃肠道黏膜和皮肤等也可以分泌。MT具有抗氧化作用，可以清除自由基，参与调节多种分子途径，例如炎症、增殖、凋亡和迁移。基础研究[1]显示，MT可能对OA具有保护作用，其可参与调节OA软骨降解过程中的氧化应激过程、促炎细胞因子分泌、线粒体功能紊乱等。鉴于未见相关临床研究，故该研究拟测定膝OA患者血清MT及OA血清标志物水平，利用磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)评估膝关节结构改变，探讨血清MT水平与膝OA患者血清标志物及关节结构间的关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集2012年1月～2013年11月就诊于安徽医科大学第一附属医院门诊的膝OA患者169例，其中男24例，女145例，年龄34～74(55.61±8.54)岁。患者均签署知情同意，并按照美国风湿病学会的膝OA诊断标准明确诊断膝OA。其排除标准如下：① 合并其它免疫性疾病，如类风湿关节炎、银屑病关节炎、反应性关节炎等；② 严重的OA患者，近一年内拟行膝关节置换术；③ MRI检查禁忌证者，如装有心脏起搏器、人工金属瓣膜、幽闭恐惧症等。详细记录患者的一般情况，如性别、年龄、病程、身高、体质量、职业、外伤史等，然后对受累侧膝关节行MRI检查。将OA患者以MT中位数(0.91 ng/ml)水平分为两组，包括MT高水平组和MT低水平组。

1.2 指标测量

1.2.1身高与体质量测量 受试者脱鞋免冠，由专人使用同一身高体重计(RGZ-120型)按标准进行准确测量。身高及体质量分别精确至0.1 cm及0.1 kg以记录。计算身体质量指数(body mass index，BMI)，BMI=体质量(kg)/身高2(m2)。

1.2.2标本采集 取患者空腹晨血置入不抗凝干燥试管中，分离血清后保存于-80 ℃冰箱中，ELISA法测定患者血清MT、基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)、MMP-10、MMP-13、白介素(interleukin，IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、瘦素、抵抗素和脂联素水平。

1.2.3MRI检测方法 对受试者受累侧膝关节(如果双侧受累，取症状较重的一侧)进行3.0 T-MRI扫描(GE Signa 3.0 T HDXT)，图像序列包括：① 三维脂肪抑制T1加权梯度回波序列，翻转角30°，重复时间(repetition，TR)31 ms，回波时间(echotime，TE)6.71 ms，视野(field of view，FOV)16 cm，矩阵512×512，层厚1.5 mm，无间隔扫描60层，采集时间5 min 58 s；② T2加权快速自旋回波序列，翻转角90°，TR 3 067 ms，TE 112 ms，FOV 16 cm，矩阵228×256，层厚2 mm，层间隔0.5～1.0 mm，扫描15层。所有图像信息导入Osirix软件中，由专人测量。软骨体积在T1加权MRI上进行测定，测量部位为髌骨软骨、内侧胫骨软骨和外侧胫骨软骨。首先利用Osirix软件测量每个层面的软骨面积，然后通过软件计算总软骨体积。软骨缺损在T2加权MRI上进行评定，测量部位为髌骨软骨、内侧及外侧股骨软骨、内侧及外侧胫骨软骨。软骨缺损评估通过对各个测量部位进行评估分级，然后相加得出总评分。软骨缺损分级标准为：0级(正常软骨)；1级(仅有软骨局灶性低信号或点状缺损，软骨表面完整)；2级(缺损厚度<50%)；3级(缺损厚度≥50%)；4级(软骨全层缺失，暴露软骨下骨)。软骨下骨髓损害(bone marrow lesions，BMLs)在T2加权MRI上测量，测量部位为髌骨、内侧股骨、外侧股骨、内侧胫骨及外侧胫骨。先对各个测量部位进行分级，然后相加计算总BMLs。BMLs分级标准为：0级(未见软骨下骨髓损害)；1级(软骨下骨髓损害面积<总面积的25%)；2级(软骨下骨髓损害面积介于总面积的25%～50%)；3级(软骨下骨髓损害面积≥总面积的50%)。

2 结果

2.1 一般人口学特征分析MT高水平组和MT低水平组间性别、年龄、BMI、血清瘦素、脂联素、MMP-10及MMP-13水平、关节软骨体积、关节软骨缺损和BMLs差异均无统计学意义。在MT高水平组中，患者血清MMP-3水平更低，但血清IL-6、TNF-α和抵抗素水平更高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 血清MT水平和血清标志物的相关性分析调整混杂因素(包括性别、年龄和BMI)后，血清MT水平与MMP-3水平呈负相关性(OR=0.55，95%CI:0.37～0.81，P=0.03)，血清MT水平与IL-6、TNF-α和瘦素水平呈正相关性(OR=2.05，95%CI:1.27～3.29；P=0.003；OR=2.25，95%CI:1.40～3.63，P=0.001；OR=1.59，95%CI:1.05～2.42，P=0.028)，与其他血清学标志物无显著相关性，见表2。

表1 一般人口学特征

表2 MT和血清标志物的相关性

*调整因素为：年龄、性别、BMI

表3 MT和OA关节结构的相关性

*调整因素为：年龄、性别、BMI

2.3 血清MT水平和膝关节结构的相关性分析调整混杂因素(包括性别、年龄和BMI)后，血清MT水平和关节软骨体积、关节软骨缺损及BMLs间均无显著相关性，见表3。

3 讨论

本研究显示血清MT水平与膝OA患者血清MMP-3水平呈负相关性，与血清IL-6、TNF-α和瘦素水平呈正相关性，与关节结构无显著相关性。

MMPs参与软骨细胞外基质降解，MT可能通过抑制MMPs的产生对OA关节软骨发挥保护作用。体外实验显示MT抑制OA患者膝关节软骨细胞中MMP-3和MMP-13的产生，其阻断软骨细胞中烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT)和活化T细胞核因子-5(nuclear factor of activated T cells-5，NFAT-5)信号通路，从而降低软骨损伤相关细胞因子的表达，发挥软骨保护作用[2]。Wu et al[3]表明MT可降低急性脊髓损伤模型小鼠脑脊液中MMP-3的表达。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有向软骨分化的能力[4]。Liu et al[5]研究发现，在促进MSCs向软骨细胞分化的培养基中，MT可促进MSCs中软骨基质及软骨形成基因的表达，下调MMP-1、MMP-2、MMP-9和MMP-13的mRNA表达，减少活性氧的积累，促进超氧化物歧化酶的表达，进而发挥软骨细胞保护作用。本研究显示MT和MMP-3水平呈负相关性，支持MT可能抑制OA患者MMP3的表达。

越来越多的证据表明，炎症在OA中发挥重要作用，相关炎症介质包括炎症细胞因子、脂肪细胞因子和生长因子等[6]。Galbo et al[7]发现风湿性多肌痛患者血清MT、IL-6、IL-8和TNF-α水平均较健康对照者升高。动物实验[8]显示，皮下注射MT显著增加关节炎模型小鼠关节组织中IL-1β和IL-6水平。Gonciarz et al[9]发现服用MT可增加非酒精性肝病患者血清瘦素及脂联素水平。然而也有研究持相反结论，Yi et al[10]发现外源性MT可降低应激状态下大鼠体内IL-1和IL-6的水平。体外实验[11]显示MT可抑制SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中IL-1、IL-6和TNF-α蛋白质及mRNA的表达。Celinski et al[12]研究发现MT可降低肝硬化患者血浆瘦素水平，升高健康受试者血浆瘦素水平。本研究显示，OA患者血清MT水平和IL-6、TNF-α及瘦素水平呈正相关性，结合MT具有抗炎、抗氧化特性，故推测患者血清中MMP-6、TNF-α和瘦素的升高可能反馈性地引起MT的升高以拮抗这种炎症反应。以上这些矛盾的研究结果可能和MT的给药剂量、给药时间、疾病种类、实验条件及研究方法的差异有关。MT和OA患者血清炎症因子及脂肪因子的关系尚无定论，值得进一步研究。

MT和OA关节结构相关性的流行病学研究目前国内外尚无报道。动物实验[13]显示关节腔注射MT可明显改善兔OA模型关节软骨的形态变化。Hong et al[14]发现单用MT干预1周可抑制鼠OA模型中MMP-13活性或表达，明显改善OA软骨组织学形态异常；MT干预4周对关节软骨则无明显保护作用；但其使用CT三维重建技术显示，MT联合运动长期干预显著改善OA小鼠胫骨软骨下骨损害、骨赘形成及骨小梁厚度，故表明短期使用MT对OA具有保护作用，长期治疗效果不明显，MT联合适度运动对OA具有保护作用。本研究显示血清MT水平和关节软骨体积、关节软骨缺损和BMLs无显著相关性，结果暂不支持MT对膝OA具有保护作用。结合本研究显示MT和OA血清标志物之间有相关性，推测MT可能参与调节OA血清标志物水平，但由于本研究为横断面研究，其对膝OA是否发挥保护作用尚无法给出定论，仍需更多研究阐释二者之间的关系。

本研究具有一定的局限性，首先，横断面研究的相关性不能代表数据之间的因果关系，需要纵向研究来进一步证明。其次，本研究纳入的患者均自医院门诊连续收集，不是随机选择，可能会导致选择偏移。最后，本研究检测的是血清中MT水平，而不是滑液水平，其局部作用仍然未知。

综上所述，血清MT水平与膝OA患者MMP-3水平呈负相关性，与血清IL-6、TNF-α和瘦素水平呈正相关性,与关节结构无相关性。本临床研究结果显示MT在膝OA中可能发挥一定作用，但需要进一步临床研究证实。