IL-22基因单核苷酸多态性与结直肠癌易感性和临床病理参数的相关性

叶石才，郑学宝,2，朱 朱，周 宇，钟 宇，黄 哲，王永存，叶 华，邹 颖，冯锦山，迟宏罡，朱宇珍

结直肠癌是世界范围内高发的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率在男性和女性患者中均位列第三位。随着我国经济的发展、人民生活方式和膳食结构的改变，结直肠癌的发病率呈逐年上升的趋势，已跃居为我国排第四位的恶性肿瘤性疾病，中晚期占大多数[1]。不同临床分期的结直肠癌的治疗方法不同，准确判断肿瘤的病理及临床分期非常重要。结直肠癌是多基因改变、多因素影响、多阶段发展的高度恶性肿瘤，其中宿主的遗传易感性在结直肠癌发病中的作用越来越受到重视[2]。目前已发现多种基因直接参与和调节机体的免疫应答，并决定这人群或个体易感性的差异[3-7]。

IL-22是IL-10家族成员之一，介导上皮免疫和黏膜组织修复，主要由激活的αβ T细胞、γδ T细胞、NK T细胞和固有淋巴细胞(innate lymphoid cells，ILCs)分泌。目前诸多研究[8]表明IL-22在结直肠癌的天然和获得性保护性免疫中起重要作用，且参与调节肿瘤细胞增殖和细胞周期的信号通路，但宿主基因对其功能的调控及其与结直肠癌的易感性的关系尚不清楚。有关IL-22基因多态性可能与结直肠癌易感性的研究鲜有报道。该研究主要是对IL-22基因单核苷酸多态性进行研究，探讨SNP位点(rs2227474和rs2227483)与结直肠癌发病的关系，以及其是否与结直肠癌患者的临床特点、病理特征有相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂和仪器 全血DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；热启动Taq酶购自日本TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；紫外分光光度计NanoDrop购自美国Thermo Scientific公司；实时荧光定量PCR-7500仪购自美国ABI公司。

1.1.2病例资料 选取广东医科大学附属医院确诊结直肠癌患者306例。按照《结直肠癌诊疗规范(2015年版)》诊断标准，通过磁共振成像(MRI)或计算机断层扫描(CT)检查肿瘤大小和区域淋巴结转移情况。临床阶段根据国际癌症防治联盟(UICC)标准进行分级。结直肠癌患者均经组织病理学检查或在抽血前没有接受治疗。健康对照组为医院体检者358例。所有研究对象签署由广东医科大学附属医院伦理委员会批准的知情同意书，符合医学伦理学规定。

1.2 方法

1.2.1DNA的提取及纯化 用肝素锂抗凝管收集静脉血，采用Qiagen 全血DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，严格按照说明书操作。质量控制：取DNA样本2 μl，用紫外分光光度计NanoDrop测定DNA纯度和浓度，若OD260/OD280>1.8，OD260/OD230>2.0，则DNA纯度合格。

1.2.2引物设计与合成 TaqMan探针和引物设计采用7500实时荧光定量PCR仪随机软件Primer Express 3.0设计。rs2227473和rs2227483位点设计的两条探针分别采用美国AB公司的VIC和FAM 进行荧光标记。

1.2.3SNP等位基因分型 取纯度合格的DNA样本，在384孔板扩增待测样本，反应体系为10 μl，其中通用PCR混合液(2×TaqMan genotyping Master Mix)5 μl，引物与探针混合液(40×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix)0.25 μl，DNA(50 ng/μl)1 μl。PCR扩增反应条件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40个循环。在PCR扩增过程中，若样本为等位基因1的纯合子时，仅可检测到VIC荧光；若样本为等位基因2的纯合子时，仅可检测到FAM荧光；若样本为杂合子时，可同时检测到FAM和VIC两种荧光。

1.3 统计学处理采用GraphPad Prism 6软件进行统计分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。采用χ2检验确定结直肠癌组与健康对照组的等位基因频率的差异，进一步通过计算比值比(odds ratio，OR)和95%可信区间(95% confidence intervals，95%CI)来评估结直肠癌发生与IL-22等位基因的相关性。分析结直肠癌患者不同基因型与临床病理表型的相关性，如年龄、性别、血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、原发肿瘤延长、淋巴结状态、转移和肿瘤分期等。

2 结果

2.1 研究人群特征结直肠癌组和健康对照组之间年龄差异无统计学意义(χ2=0.483，P>0.05)。 其中结直肠癌组和健康对照组性别差异无统计学意义(χ2=0.576，P>0.05)，提示结直肠癌组和健康对照组间具有可比性。见表1。

表1 研究人群特征

2.2 rs2227473、rs2227483位点的多态性与结直肠癌的易感性的关联性分析通过对两组人群rs2227473、rs2227483位点的基因分型进行分析，结果显示rs2227473位点的单核苷酸多态性与结直肠癌的易感性相关，两者之间的差异具有统计学意义(P=0.000 3)，rs2227483位点的单核苷酸多态性与结直肠癌的易感性无相关性(P=0.99)。见表2。

2.3 rs2227473、rs2227483位点的多态性与结直肠癌CEA的关联性分析血清CEA水平能预测结直肠癌的预后及复发，是应用于临床的结直肠癌肿瘤标志物中重要的一种。通过分析结直肠癌患者rs2227473、rs2227483位点多态性与CEA的相关性，结果显示rs2227473、rs2227483位点的单核苷酸多态性与结直肠癌的易感性无相关性(P=0.93，P=0.88)，见表3。

表2 rs2227473、rs2227483位点的多态性与结直肠癌的易感性的关联性分析

表3 rs2227473、rs2227483位点的多态性与结直肠癌CEA的关联性分析

表4 rs2227473、rs2227483位点的多态性与结直肠癌原发肿瘤(T)的关联性分析

表5 rs2227473、rs2227483位点的多态性与结直肠癌区域淋巴结(N)的关联性分析

表6 rs2227473、rs2227483位点的多态性与结直肠癌区域远处转移的关联性分析

表7 rs2227473、rs2227483位点的多态性与结直肠癌临床分期的关联性分析

2.4 rs2227473、rs2227483位点的多态性与结直肠癌原发肿瘤(T)的关联性分析统计分析rs2227473、rs2227483位点多态性与结直肠癌原发肿瘤的相关性，结果显示rs2227473、rs2227483位点的单核苷酸多态性与结直肠癌原发肿瘤的浸润程度无相关性(P=0.71，P=0.84)，见表4。

2.5 rs2227473、rs2227483位点的多态性与结直肠癌区域淋巴结(N)的关联性分析结果显示rs2227473、rs2227483位点的单核苷酸多态性与结直肠癌区域淋巴结转移无相关性(P=0.76，P=0.71)，见表5。

2.6 rs2227473、rs2227483位点的多态性与结直肠癌区域远处转移的关联性分析通过对rs2227473、rs2227483位点的多态性与结直肠癌区域远处转移的关联性分析，结果显示，二者均无相关性(P=0.39，P=0.92)，见表6。

2.7 rs2227473、rs2227483位点的多态性与结直肠癌临床分期的关联性分析根据临床分期标准，结直肠癌患者分为Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期。结果显示，rs2227473位点G在Ⅰ+Ⅱ期患者中的基因频率为80.3%，在Ⅲ+Ⅳ期患者中的基因频率为91.6%，差异具有统计学意义(P<0.000 1)。rs2227483位点在Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的基因频率差异无统计学意义，见表7。

3 讨论

结直肠癌易感基因的筛选和确定，不仅是结直肠癌发生高危人群预测诊断和制定相应干预决策的依据，同时也是结直肠癌靶向基因和药物治疗的基础。随着结直肠癌易感基因研究的不断深入，已发现有大量的易感基因SNP与结直肠癌易感性存在相关性。COX-2基因多态性-765G/C与结肠直肠癌特别是直肠乙状结肠癌的易感性增加有关[4]；血管紧张素转换酶(ACE)插入/缺失(I/D)多态性可能增加结直肠癌患者淋巴结转移的发病风险[5]；IL-10基因-592A/C降低了结直肠癌的风险[6]；细胞间黏附分子1(ICAM-1)基因K469E多态性与结直肠癌易感性和多药耐药性高度相关[7]； MYCrs11777210被证实是结肠直肠癌高风险基因多态性位点，可作为潜在预测性生物标志物之一[8-10]。

IL-22早期研究主要集中在炎症性疾病与自身免疫性疾病，最近研究[10]表明，IL-22在肿瘤的免疫调节中也发挥着重要作用。Zhuang et al[11]通过免疫荧光双染的方法证实了胃癌组织中存在Th22细胞的表达；通过对76例胃癌患者研究进行分析，显示肿瘤组织中CD4+IL-22+T细胞比例在肿瘤组织中明显高于肿瘤引流淋巴结、非肿瘤以及癌旁组织。同时该研究还显示Th22细胞低表达的患者在21个月的生存率方面明显优于高表达的患者，表明Th22细胞的髙表达意味着较差的预后。Liu et al[10]通过对32例胃癌患者和19例健康志愿者外周血的单个核细胞进行流式细胞技术检测，发现表达IL-22的辅助性T细胞和Th22细胞在胃癌患者中高度表达，同时Th22细胞旳比例与IL-22浓度呈正相关性，IL-22在进展期胃癌患者的表达量明显高于早期胃癌患者，表明IL-22与胃癌的病情进展密切相关。研究表明结直肠癌患者的肿瘤组织及癌旁组织中均存在IL-22蛋白的表达，但肿瘤组织中表达更为明显，且TNM Ⅰ～Ⅳ期的Th22细胞比例明显髙于TNM Ⅰ～Ⅱ期，提示IL-22细胞结直肠癌微环境中聚集，并且随着肿瘤的进展含量增高，表明IL-22或许可以作为结直肠癌患者评价预后的一项重要指标[11-12]。

人IL-22基因位于12q15，大约距离IL-26编码基因上游52 kb，距离IFNG编码基因上游99 kb。整个编码区位于30 785 331 nt～30 790 587 nt 之间的约5.3 kb，共包含5个外显子。开放读码框长度537 bp，编码蛋白长度179个氨基酸[10]。IL-22及其受体(IL-22RA1/IL-22RA2)基因单核苷酸多态性与多种疾病的易感性有关，包括炎症反应性疾病、肿瘤和慢性感染性疾病。其中，IL-22基因SNP(rs1179251)被报道与大肠癌易感性有关[12]；IL-22基因SNP(rs1012356、rs1179251和rs2256111)可能与 HCV感染后的病毒清除和干扰素治疗应答反应有关[13]，此外，IL-22RA1 基因SNP(rs4292900、rs4648936和rs16829225)与重症慢性鼻鼻窦炎的发生密切相关[14]；IL-22RA2基因SNP(rs276474)与多发性硬化的发生有关，其具体机制与 IL-22RA2 基因多态性对巨噬细胞功能调节有关[15]。本研究检测了结直肠癌患者和健康对照者IL-22两个SNP位点(rs2227483和rs2227473)的多态性，结果提示IL-22基因rs2227473位点与结直肠癌的易感性有相关性；除此以外，IL-22基因rs2227473位点与临床分期有显著相关性。这些数据表明，IL-22基因rs2227473位点不仅参与癌症的起始，而且可能参与结肠直肠癌的进展。但是这个位点与CEA、原发肿瘤扩展情况、淋巴结状态和转移情况的参数之间无显著相关性。因此，推断IL-22基因型可能是结直肠癌患者生存的预测指标。

综上所述，IL-22基因rs2227473多态性与结直肠癌的易感性和临床分期相关，其中携带等位基因G增加结直肠癌的发生风险。但本研究的研究对象具有样本量小、地域局限和人种差异小等缺陷，因此，为进一步揭示IL-22基因多态性与结直肠癌的关系，在不同国家、地区和种族的人群中进行大样本的研究是很有必要。