皮质下缺血性血管病患者ApoE基因多态性及血清亲环素A浓度对认知障碍的影响

王 瑶，倪明珠，刘文灿，宋莉莉，王兆平，王文静

皮质下缺血性血管性认知障碍(subcortical ischemic vascular disease with cognitive impairment，SVCI)是血管性认知障碍的主要亚型之一，是引起老年性认知障碍的第二大原因[1]，因其较高的发病率和较好的均质性[2]，一直以来被研究者广泛关注。目前SVCI发病的遗传机制仍不清楚。载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因是热门的痴呆备选基因之一，已有研究[3]证实，携带ApoE ε 4等位基因的皮质下缺血性血管病(subcortical ischemic vascular disease，SIVD)患者较未携带者出现认知障碍的风险增高，但具体机制仍不明确。而在Bell et al[4]构建的ApoE转基因小鼠模型中显示，亲环素A(cyclophilin A，CypA)可能是ApoE ε 4等位基因引起脑血管功能异常及神经元退行性变的关键因子。该研究为进一步探索ApoE基因多态性及血清CypA浓度对SIVD患者认知障碍的影响，进行了下列研究。

1 材料与方法

1.1 病例资料

1.1.1SVCI组 选取2017年9月～2018年4月安徽省立医院神经内科SIVD住院患者126例，其中SVCI组为82例。SIVD纳入标准参照Galluzzi et al[5]提出的影像学标准并加以修改：① 年龄50～80岁； ② 受教育年限≥5年； ③ 头颅磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)检查示脑室旁和(或)深部白质病变(white matter lesions，WML)及深部灰质多发性腔隙性梗死灶(lacunar infarcts，LI)。所有入选患者知情同意并签署知情同意书。SVCI诊断标准为：① 符合SIVD纳入标准；② 患者有明确的认知功能下降，蒙特利尔认知评估量表(montreal cognitive assessment，MoCA)量表评分<26分，记忆、视空间、语言、执行中≥1个认知领域受损；③ 保留独立生活能力；④ 认知功能损伤与脑血管病间具有相关性：认知功能损害发生在卒中后3个月内；或无明显脑血管病时间发生，但存在信息处理速度明显减慢，且具有早期尿、便障碍、早期步态异常、人格和性格改变特征之一[6-7]。

1.1.2皮质下缺血性血管病无认知障碍组(SIVD withnon-cognitive impairment，SNCI)纳入标准 选取同期年龄、性别相匹配，认知功能正常(MoCA量表评分≥26分)的SIVD患者44例作为SNCI组。

1.1.3排除标准 ① 有脑外伤、皮质梗死、脑出血、脑肿瘤史；② 有阿尔兹海默病、帕金森病、路易体痴呆等其他引起认知损害的疾病；③ 代谢、多发性硬化、免疫等非血管因素引起的脑白质病变；④ 有风湿结缔组织及炎性疾病、传染病史；⑤ 患有严重的躯体或精神疾病；⑥ 不能配合神经心理学评估者。

1.2 研究方法

1.2.1一般临床资料的收集 收集所有入选者的年龄、性别、受教育程度、吸烟饮酒史、高血压病史、糖尿病病史、痴呆及精神疾病家族史等一般资料，并记录空腹血糖、血脂等指标。

1.2.2神经影像学评估 应用3.0 T MRI机(德国西门子公司)扫描，依据头颅MRI T 2像、液体衰减反转恢复序列成像，从皮质下LI数目及WML两方面对所有受试者脑损伤程度进行评估。LI定义为皮质下直径为3～15 mm、边界清楚的缺血性病灶(皮质下和/或脑室旁)[8]。脑白质病变程度依据Fazekas et al[9]的分级方法分为3级：1级(轻度，斑点状病变)；2级(中度，病变开始融合)；3级(重度，融合成弥漫性病变)。

1.2.3神经心理学评估 采用MoCA量表、日常生活活动能力量表(activity of dailyliving scale，ADL)进行整体认知功能及日常生活能力评估；应用哈金斯基缺血指数量表(hachinskiischemic score，HIS)鉴别SVCI和老年性认知障碍、汉密顿抑郁量表(hamilton depression scale，HAMD)评估抑郁状态。

1.2.4血液标本的收集和检测 采取受试者空腹外周静脉血A、B两管各4 ml，A管为聚丙烯EDTA抗凝真空采血管，4 ℃冰箱内保存，进行ApoE基因测序；B管未添加抗凝剂，采血后立即3 000 r/min离心10 min，分离血清并保存于-80 ℃冰箱中，检测CypA浓度。

1.2.4.1ApoE基因检测方法 采用snapshot检测方法检测所有受试者ApoE基因型，按试剂盒操作步骤对共ApoE共2个SNP位点扩增检测。① 提取白细胞DNA；② PCR扩增：设计引物序列，反应条件：96 ℃、1 min，96 ℃、10 s，60 ℃、30 s，52 ℃、5 s共30个循环；③ DNA测序：取1 μl延伸产物，加10 μl高度去离子甲酰胺，95 ℃变性3 min，立即冰水浴，上测序仪(Snapshot试剂盒、3730 XL基因测序仪均购自美国ABI公司)。

1.2.4.2CypA含量测定 应用ELISA法测定血清CypA浓度。操作方法严格按照试剂盒(购自上海联硕生物科技有限公司，批号：201804)说明书进行。

表1 SVCI和SNCI两组一般临床资料及血清CypA浓度比较

a采用χ2检验；b采用Mann-WhitneyU检验；c采用独立样本t检验；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇

表2 SVCI和SNCI两组ApoE基因型与等位基因频率分布比较[n(%)]

a采用Fisher确切概率检验

2 结果

2.1 SVCI和SNCI两组一般临床资料及血清CypA浓度比较SVCI和SNCI两组间在受教育年限、吸烟饮酒史、糖尿病比例、Fazekas分级等方面差异无统计学意义(P>0.05)；与SNCI组比较，SVCI中的高血压比例、年龄、总胆固醇水平及LI数量等方面较SNCI组高，差异有统计学意义(P<0.05)。SVCI组血清CypA浓度高于SNCI组(P<0.01)。见表1。

2.2 SVCI和SNCI两组ApoE基因频率的比较SVCI组中共检出2/2、2/3、2/4、3/3、3/4、4/4 6种基因型以及ε 2、ε 3、ε 4 3种等位基因；SNCI组中共检出2/3、2/4、3/3、3/4、4/4 5种基因型以及ε 2、ε 3、ε 4 3种等位基因。其中SVCI组中3/4基因型及ε 4等位基因频率(25.6%/20.7%)显著高于SNCI组(6.8%/6.8%)，3/3基因型及ε 3等位基因频率(51.2%/70.1%)明显低于SNCI组(81.8%/88.6%)，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 ε 4基因携带组和ε 4基因非携带组两组间血清CypA浓度的比较ε 4基因携带组血清CypA浓度较ε 4基因非携带组高(ε 4等位基因携带组包括基因型为ApoE 2/4、ApoE 3/4、ApoE 4/4者，ε 4等位基因非携带组包括基因型为ApoE 2/2、ApoE 2/3、ApoE 3/3者)，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 两组间血清CypA浓度的比较

2.4 SVCI组危险因素logistic回归分析以有无SVCI作为因变量(SVCI=1，SNCI=0)，将SVCI主要的危险因素进行logistic回归分析(自变量赋值为如下：有高血压=1，无高血压=0；携带ε 4基因=1，未携带ε 4基因=0；其余变量均以连续性变量直接纳入模型分析)，结果显示：高血压、血清总胆固醇水平增加、血清CypA浓度的增加以及携带ε 4等位基因，均增加SVCI的发病风险(P<0.05)。见表4。

3 讨论

ApoE基因位于19号染色体长臂上，具有ε 2、ε 3及ε 4 3种不同的等位基因，研究普遍认为在3种等位基因中，携带ε 4等位基因者体内LDL-C水平及出现动脉粥样硬化的风险较高[10]，且会加剧脑白质损伤、引起认知功能减退[11]，与SVCI具有相关性[3]。目前为止，已有不少研究者[12-14]从颅内β淀粉蛋白沉积、动脉粥样硬化及血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)破坏等不同方面进行发病机制的探索，但ε 4等位基因和SVCI之间具体发病机制仍不明确。

表4 SVCI影响因素多因素logistic回归分析

CypA作为亲环素家族中的一员，参与了蛋白质折叠、胆固醇的代谢、免疫功能的调节和机体炎性反应等许多生物学过程，与冠心病、系统性红斑狼疮等疾病关系密切[15]，近年来也有研究[16]显示CypA在脑血管病中发挥重要作用。

本研究检测了SVCI组和SNCI组ApoE基因多态性及血清CypA浓度，旨在进一步探索SVCI与ApoE基因多态性及血清CypA浓度之间的关系。结果显示，SVCI组患者的ε 4等位基因频率及血清CypA浓度均高于SNCI组，提示ε 4等位基因和CypA在SVCI发病过程中可能发挥一定作用。为了进一步分析ε 4等位基因和CypA是否具有协同作用，本研究将入组患者根据是否携带ε 4等位基因重新分组，对两组血清CypA浓度进行比较，结果显示ε 4等位基因携带组血清CypA浓度较非携带者高。

通过对上述研究结果进行讨论与总结，ε 4等位基因和CypA促进SVCI的发生、发展的机制可能如下：① ε 4等位基因和CypA均可引起小动脉硬化、脂质斑块形成，导致血管管腔狭窄甚至闭塞、脑血流灌注不足，从而出现皮质下LI或白质缺血性改变，破坏额叶-皮质下环路或(和)丘脑皮质环路，表现出以执行功能受损为主的认知功能减退[6]；② ε 4等位基因可通过激活CypA-MMP-9途径，引起BBB的破坏。CypA是一种前炎症因子，当机体在应激状态下，由受损的血管内皮细胞或血管平滑肌细胞分泌，CypA可以促进血管平滑肌细胞中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，如MMP-2和MMP-9的活化[17]，进而降解BBB的紧密连接蛋白、胶原蛋白IV和一些基膜蛋白，破坏BBB的完整性，从而造成神经元摄取多种血源性神经毒性物质，最终引起认知功能下降。但由于本研究样本量有限，上述机制还需要大样本、多中心的研究来进一步进行验证。

同时本研究对SVCI影响因素进行了多因素分析，结果显示除携带ε 4等位基因和血清CypA浓度增高外，高血压及血清总胆固醇水平增高也会增加SVCI的发病风险，这与国内外相关研究[18-19]结果一致，故而控制上述因素对预防SVCI具有重要意义。