光滑念珠菌MSH2基因突变与氟康唑耐药的研究

刘赟蕾，宫婷婷，王中新

近年来，侵袭性光滑念珠菌感染发病率不断上升，光滑念珠菌对常规抗真菌药物的耐药情况愈加严重，且多重耐药光滑念珠菌检出率也明显升高，给临床抗真菌感染治疗带来巨大挑战。研究[1]表明，真菌耐药性的产生归因于基因突变，从点突变到整个染色体缺失、插入、重排等。DNA错配修复(mismatch repair,MMR)系统维持DNA复制的保真性，其广泛存在于生物体中，该系统缺陷与基因突变率增加有关[2]。在人类基因组中，该系统缺陷与某些癌症(如非息肉型结直肠癌)相关[2-3]；在细菌中，MMR系统缺陷是细菌获得性耐药性的重要机制[4]；在白色念珠菌中，MMR系统缺陷导致基因不稳定性增加，更快获得对氟康唑耐药性[5]。MSH2基因为核MMR基因(属MMR系统基因的一种)，相关研究[1]表明MSH2基因突变为光滑念珠菌获得多重耐药性的驱动因素，且具有特定错义突变的菌株在体外表现出更高的耐药性。该实验通过分析氟康唑敏感型、剂量依赖性敏感型(susceptible-dose dependent,S-DD)及耐药型光滑念株菌中MSH2基因突变情况，旨在探讨光滑念珠菌MSH2基因突变与氟康唑耐药的关系。

1 材料与方法

1.1 菌株来源收集安徽医科大学第一附属医院检验科2017年7月～2018年7月的门诊及住院患者的痰、尿、血液或分泌物等标本中分离获得的光滑念珠菌，标本源自同一患者同一住院时间段同一部位的重复菌株只纳入一株分析，菌株保存在-80 ℃菌株库。选取光滑念珠菌ATCC MYA-2950作为真菌鉴定的质控菌株，白色念珠菌ATCC 10231作为真菌药敏的质控菌株，使用大肠杆菌ATCC 8739作为质谱仪器的校准菌株。

1.2 仪器和试剂酵母基因组DNA提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司)；DL 5 000 DNA Marker 和Premix Ex Taq 酶体系(日本TaKaRa公司)；RPMI1640液体培养基(美国GIBCO公司)；MOPS(北京索莱宝技术有限公司)；ATBFUNGUS3试剂盒、VITEK MS IVD (V2.0) 质谱仪 (法国Biomérieux公司)；PCR仪(德国 Biometra公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)；全自动凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)等。

1.3 方法

1.3.1菌株鉴定 将菌株从-80 ℃菌株库中取出，接种于科玛嘉念珠菌显色培养基，35 ℃培养48 h初步鉴定，再用VITEK MS IVD (V2.0) 质谱仪进一步鉴定，以光滑念珠菌ATCC MYA-2950作为鉴定质控菌株，质谱仪器的校准菌株大肠杆菌ATCC8739。

1.3.2药敏试验 采用ATBFUNGUS3试剂盒进行体外药敏试验，药敏结果根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐折点判读，以白色念珠菌ATCC 10231作为真菌药敏的质控菌株，随机选取19株氟康唑耐药菌株、15株氟康唑中介菌株和23株敏感菌株，-80 ℃保存备用。

1.3.3制备DNA模板 将上述菌株从-80 ℃菌株库中取出，接种于沙保弱培养基35 ℃培养48 h传代2次进行复苏，挑取单个菌落于5 ml RPMI1640液体培养基，37 ℃、250 r/min震荡培养16 h。取1 ml菌液离心收集菌体，按照酵母基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取DNA，产物放于-20 ℃冰箱备用。

1.3.4扩增MSH2基因及测序MSH2基因引物设计参照已有文献[6]委托上海生工生物工程有限公司合成，使用3对引物33F/1188R、1013F/2170R、1914F/2985R 对MSH2基因分段扩增，所得产物分别标记为MSH2基因片段1、MSH2基因片段2、MSH2基因片段3，引物序列见表1。50 μl PCR反应体系为5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μl，PrimeSTAR GXLDNAPolymerase 1 μl，dNTPMixture(各2.5 mmol/L ) 4 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，DNA模板(25 ng/μl)2 μl，灭菌双蒸水31 μl。PCR反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环35次，最后72 ℃延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，采用全自动凝胶成像仪中观察拍照。将PCR产物送至上海生工公司测序，测序结果应用BLST软件，与标准序列(KY110695.1-KY110696.1)进行比对分析。

表1 MSH2基因PCR引物序列

1.4 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行分析，3组实验菌株出现MSH2基因突变频率比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义；3组之间的两两比较以P<0.016 7为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光滑念珠菌药敏试验结果经鉴定，共157株光滑念珠菌，对氟康唑等5种抗真菌药物的药敏分析结果见表2，同时存在唑类交叉耐药及多药耐药现象。

表2 157株光滑念珠菌体外药敏结果情况(%)

2.2MSH2基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果以随机选取的57株研究菌株的DNA为模板，对MSH2基因分段行PCR扩增，每株均获得预期大小的片段。部分菌株PCR产物电泳结果见图1。

图1 MSH2基因分段PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

A:MSH2基因片段1；B:MSH2基因片段2；C:MSH2基因片段3；M：DNA Marker；P:阳性对照(已经实验室检测确认为光滑念珠菌MSH2基因的DNA)；N:阴性对照；1～4：部分氟康唑耐药菌株；9～12：部分S-DD菌株；17～20：部分敏感菌株

2.3MSH2基因测序结果目的基因测序结果与Genbank中MSH2基因标准序列进行Blast分析比对，57株光滑念珠菌共检测出3个非同义突变位点C622T/A2669T、G715T，分别对应氨基酸置换位点为P208S/N890I、V239L。19株氟康唑耐药菌株有17株发生MSH2基因突变，其中涉及C622T/ A2669T突变2株，涉及G715T突变15株，未发现3个非同义突变位点同时出现在同一菌株；15株氟康唑S-DD菌株有13株发生MSH2基因突变，均只涉及G715T一个非同义突变位点；23株敏感菌株有10株发生MSH2基因突变，也均只涉及G715T一个非同义突变位点。见表3。

设α=0.05为检验水准，氟康唑耐药组出现MSH2基因突变频率(89.5%)与S-DD组(86.7%)、敏感组(43.5%)比较，差异具有统计学意义(χ2=13.162，P=0.002)。两两比较，以α′=0.016 7 为检验水准，结果提示：耐药组MSH2基因突变频率显著高于敏感组(χ2=9.587，P=0.003)；耐药组与S-DD组比较，差异无统计学意义(χ2=0.064，P=1.000)；中介组与敏感组比较，差异有统计学意义(χ2=7.088，P=0.016)。

表3 3组实验菌株出现MSH2基因突变情况

3 讨论

近年来，光滑念珠菌已成为全球第二大引起侵袭性真菌感染的病原体[7]，目前可用于一线治疗的抗真菌剂有限，且考虑药物对人体副作用(如两性霉素B的肾毒性)及药品价格方面，临床较常使用唑类药物。研究[8-9]表明，光滑念珠菌对氟康唑的耐药率逐年升高，Xiao et al[8]通过对中国医院侵袭性真菌检测网研究显示2009～2014年间光滑念珠菌对氟康唑的耐药率从12.9%上升至24.0%，国外也有类似报道[9]。本研究显示，2017年7月～2018年7月从我院收集的光滑念珠菌对氟康唑耐药率达22.9%，对伊曲康唑等其它4种抗真菌药有不同程度耐药，同时存在交叉耐药和多药耐药现象，这与文献[8]报道基本一致。 相关研究表明，光滑念珠菌易对唑类产生耐药[10]，通常与ATP结合转运蛋白和易化扩散载体超家族蛋白(如CDR1、SNQ2等)表达上调有关[9]，从而有效的将药物泵出细胞外，同时药物外排泵上调通常伴随转录因子PDR1获得性突变[11]，但目前尚不清楚光滑念珠菌为何能快速获得对多种药物的耐药性。

MMR系缺陷的菌株可增强基因水平转移的频率[4]，相关研究[12]显示，缺乏DNA MMR系统的细胞，可大大提高自发突变的速率。Legrand et al[5]通过构建白色念珠菌MSH2Δ菌株，研究发现MSH2基因突变可致氟康唑耐药菌落的出现频率增加。同时，Healey et al[1]通过研究357株光滑念珠菌MSH2基因突变情况及建立MSH2Δ光滑念珠菌胃肠定植小鼠模型，发现DNA修复系统缺陷可能是导致负责调控耐药性的各种基因变化加速的原因。本实验通过研究57株光滑念珠菌MSH2突变情况，结果显示氟康唑耐药组、S-DD组MSH2基因突变频率明显高于敏感组，因此MSH2基因突变可能与氟康唑耐药有关。本次研究显示的P208S/N890I、V239L氨基酸置换位点与国外报道[1,6]一致，但未发现E231G、L269F等国外报道的其他氨基酸置换位点，这可能与实验菌株数相对较少或地理差异有关。此外，本实验显示P208S/N890I氨基酸置换位点只出现在耐药组中，可能其与出现氟康唑耐药相关性较高，这有待进一步生物学验证。同时，本研究显示敏感组也出现相对较高的MSH2基因突变频率，且有文献[13]报道MSH2基因突变出现在耐药性出现之前，这可能初步解释了光滑念珠菌为何能快速获得对氟康唑的耐药性，但仍需进一步深入研究；也可能与患者基础疾病较多、接触较多药物(如抗生素、抗肿瘤药物等)有关。此外，已有研究[1]通过对连续临床光滑念珠菌分离株的分析，结果表明MSH2基因突变发生在耐药性出现之前。

虽然有研究表明DNA MMR基因MSH2基因突变与氟康唑耐药有关，但Dellière et al[6]研究提出光滑念珠菌对氟康唑的耐药性与抗真菌药物暴露相关，且相关性优于MSH2基因突变。由于病历资料不完善，本实验未考虑患者抗真菌药物的暴露情况。另外，Healey et al[1]发现从部分医院获得的光滑念珠的MSH2基因突变频率在氟康唑敏感组与耐药组有相似水平，表明MSH2基因突变存在地理差异。

本研究为阐明光滑念珠菌MSH2基因突变与氟康唑耐药有一定关系，但MSH2突变是否导致DNA MMR蛋白表达下降，或功能活性降低，或参与调控其它耐药基因如药物外排泵等，有待进一步探讨。耐药机制的形成，复杂且多样性[14]，对其深入研究有助于临床治疗和指导用药。