儿童患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的流行病学特征及耐药性分析

李惠春，丁圣刚，卜笑松，王 建，王 旺，朱玉林

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)简称金葡菌，是儿童感染的重要病原菌，它通过定植在人类和哺乳动物身上，引起皮肤软组织的化脓感染，甚至引起机体内部炎症如心内膜炎、骨髓炎、脓毒症等危及生命的全身性感染。随着抗生素的研发与应用，这些感染曾一度得到控制，但是随着抗生素种类的增多与广泛应用，出现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)[1]。MRSA不仅对青霉素耐药，对和青霉素结构相同或相似的β-内酰胺类抗生素均耐药，甚至对氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类等抗菌药物产生耐药，给临床治疗带来巨大困难[2]。而携带杀白细胞素(panton-vanlentine leukocidin，pvl)基因的MRSA杀伤力更强，pvl是由一个分子量为34 ku的lukF-PV蛋白和一个分子量为32 ku的lukS-PV蛋白组成的双蛋白毒素成分，这两分子协同发挥作用导致多形核白细胞膜穿孔，从而杀伤白细胞[3]。有研究[4]显示其阳性率与皮肤软组织反复感染甚至引起坏死性肺炎密切相关。该研究通过对738株SA进行mecA、pvl基因检测及药敏试验，并对所有菌株的科室来源、标本来源来及耐药性进行统计学分析，了解安徽省各地区儿童与>14岁患者之间感染MRSA的流行病学特征及耐药性差异，为儿童SA感染的治疗提供病原学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源安徽省内各地区共计39所医院(包括10家省三级甲等医院、15家市三级甲等医院、1家县三级甲等医院、2家市三级乙等医院、5家市二级甲等医院、4家县二级甲等医院、1家三级民营医院、1家检验中心)上报至安徽省细菌耐药监控中心金黄色葡萄球菌738株(包括来源于儿童患者菌株153株与来源于>14岁患者菌株585株)，将所有菌株菌株按年龄分为儿童患者组与>14岁患者组，并对所有菌株科室来源及标本来源进行归类整理。标准质控菌株ATCC25923(普通金黄色葡萄球菌，不含耐药基因)及MRSA标准质控菌株ATCC43300(含mecA耐药基因)均为安徽省细菌耐药监测中心提供。

1.2 主要试剂及仪器VITEK-2型全自动微生物鉴定仪及配套的鉴定板和药敏板购自法国生物梅里埃公司；溶葡萄球菌酶、premixtaq、1 000DL Marker均购自上海生物工程有限公司；PCR扩增仪器购自德国Biometra公司；电泳仪仪器购自北京市六一仪器厂；凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司。

1.3 菌株的鉴定及药敏试验通过VITEK-2型全自动微生物鉴定仪进行金黄色葡萄球菌鉴定及药敏试验(使用配套鉴定板GP21 342及药敏卡PC33)，质控菌株为ATCC25923及MRSA标准质控菌株ATCC43300，按照2018年CLSI标准[5]判读药敏结果。

1.4 mecA、pvl引物的制备PCR扩增mecA、pvl的引物参照文献[6]设计，并委托上海生物工程有限公司合成，置于-20 ℃无菌冰箱储存备用，使用时遵使用说明合成相应溶液。具体引物序列见表1。

表1 mecA、pvl基因扩增引物

1.5 提取目的基因将临床分离提纯的738株SA全部接种至直径为9 mm的培养皿中，置于37 ℃无菌培养箱中培育18～24 h，用无菌棉签钝头分别从各个培养基中挑取4～5个菌落溶于装有200 μl灭菌双蒸水的尖头EP管中，各加入10 μl溶葡萄球菌酶置于37 ℃恒温箱中水浴30 min，然后放入电饭锅中煮沸10 min，13 000 r/min离心10 min，最后收集上清液至EP管中，即为PCR扩增所需模板基因。

1.6 PCR技术扩增mecA及pvl基因产物

1.6.1反应体系 分别往8连管每个管中各加入灭菌双蒸水10.5 μl、premix taq 12.5 μl、目的基因1 μl、上下游引物各0.5 μl，配置成25 μl反应体系，经低速离心30 s充分混匀。

1.6.2反应条件 95 ℃预变性5 min，然后开始95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸39 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保护，即扩增出所要目的基因片段。

1.7 凝胶电泳PCR产物用含0.5 μg/ml EB的2%琼脂糖凝胶，在1×TAE缓冲液中，100 V电泳90 min，在紫外灯下观察结果，片段长度为162 bp片段即为PCR扩增所得的mecA片段，片段长度为78 bp片段即为PCR扩增所得的pvl片段。

1.8 统计学处理应用SPSS 17.0 软件对临床统计资料及实验所得数据进行分析，MRSA科室来源及标本来源用成组设计行×列表资料的χ2检验进行分析，MRSA的耐药性差异用成组设计四格表资料的χ2检验进行分析，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mecA、pvl基因的PCR结果738株SA共检出MRSA 126株，MRSA阳性率为17.07%，检出pvl阳性菌株36株，阳性率为28.57%，其中分离自儿童患者的153株SA检出为MRSA菌株共计32株，阳性率为20.92%，pvl阳性MRSA菌株7株，阳性率为21.88%，分离自年龄>14岁患者的585株SA检出为MRSA菌株94株，阳性率为16.07%，pvl阳性MRSA菌株29株，阳性率为30.85%，儿童患者与>14岁患者感染SA之间检测mecA及pvl差异无统计学意义(P>0.05)。部分mecA、pvl电泳图见图1。

图1 部分MRSA mecA凝胶电泳成像图谱

M：Marker；1～10：MRSA菌株；11～14：pvl阳性MRSA菌株；15：pvl阳性对照菌株菌株16;标准质控菌株ATCC43300；17：阴性对照菌株ATCC25923

2.2 MRSA菌株来源科室统计分析儿童患者感染MRSA主要来源于烧伤科(31.25%)、外科(15.63%)、ICU(9.38%)，与>14岁患者感染MRSA来源科室之间差异有统计学意义(χ2=40.697,P<0.001)。其中儿童感染pvl(+)MRSA主要来源于外科(57.14%)、新生儿病区(28.57%)、呼吸内科(14.29%)，与>14岁患者感染pvl(+)MRSA来源科室之间差异有统计学意义(χ2=29.914,P=0.000)，具体来源科室构成比见表2。

2.3 MRSA菌株来源标本统计分析儿童感染MRSA主要来源标本为脓液(31.25%)、痰(25.00%)、创面(15.63%)，与>14岁患者感染MRSA主要来源标本之间差异有统计学意义(χ2=18.055,P=0.003)。儿童感染pvl(+)MRSA主要来源于脓液(71.43%)、血(28.57%)，与>14岁患者感染MRSA主要来源标本之间差异有统计学意义(χ2=14.593,P=0.006)。见表3。

表2 儿童与>14岁患者感染MRSA、pvl(+)MRSA科室来源构成比[n(%)]

表3 儿童与>14岁患者感染MRSA、 pvl(+)MRSA临床标本来源构成比[n(%)]

2.4 MRSA、MSSA耐药性统计分析不同种类金黄色葡萄球菌对20种常见抗生素的耐药性差异用成组设计四格表资料的χ2检验进行统计学分析。其中儿童与>14岁患者感染pvl(+)MRSA对各种常见抗生素的耐药性差异均无统计学意义(P>0.05)。儿童与>14岁患者感染pvl(-)MRSA除对庆大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平、四环素的耐药性差异有统计学意义(P=0.004、0.004、0.012、0.021、<0.001)，其余15种常见抗生素的耐药性差异无统计学意义(P>0.05)。儿童感染pvl(+)MRSA与pvl(-)MRSA对克林霉素、环丙沙星、庆大霉素的耐药性差异有统计学意义(P<0.001、<0.001、P=0.009)。具体MRSA对各种抗生素的耐药率构成比见表4。

表4 儿童与>14岁患者感染MRSA对各种常见抗生素的耐药率构成比[n(%)]

3 讨论

SA广泛存在于自然界中，是儿童感染的常见病原菌，由于抗生素使用不合理及过度泛滥，导致机体菌群失调、重新分配，大部分敏感菌被清除，MRSA在抗生素的选择压力下富集。有研究[7]报道近年来儿童感染MRSA率有急剧上升趋势，胡龙华 等[8]报道2007～2008年南昌地区儿童MRSA检出率为10.6%，张秀平 等[9]报道2010～2015年某医院儿童MRSA的检出率从21.74%上升到75.59%。由于儿童免疫力较低下，且MRSA菌株多为多重耐药菌，感染后常导致严重后果，如陈雨青 等[10]报道12例MRSA感染导致脓毒症患儿经手术、闭式引流及充分药物治疗后仍有4例不幸死亡。随着MRSA的临床分离率逐年升高且呈多重耐药，儿童一旦感染，病情常较严重且呈急剧进展趋势，能用于治疗的药物越来越少，临床治疗十分困难，给患儿及亲属带来严重的身心伤害。

本研究结果显示，2017年9月份安徽省内各地区儿童患者与>14岁患者感染金葡菌的mecA、pvl基因检出率差异无统计学意义(P>0.05 )，提示在安徽省内MRSA是儿童患者与>14岁患者感染的同等重要病原菌。MRSA总检出率为17.07%，儿童患者MRSA的检出率为20.9%，低于2014年中国细菌耐药性监测显示的MRSA平均检出率44.6%及儿童MRSA平均检出率23.8%～37.6%[11]。其中pvl阳性MRSA菌株7株，阳性率为21.88%，低于李士朋 等[12]报道的pvl检出率42.1% ，可能提示安徽省内各地区抗生素使用较合理，MRSA感染防治较好，但不排除MRSA季节性低发期，由于MRSA检出率仍较高，仍应加强MRSA感染的防治意识。

本研究结果显示，安徽省各地区儿童患者与>14岁患者感染MRSA主要来源科室之间差异有统计学意义(P<0.001)。提示儿童患者感染MRSA主要来源于创伤、危重科室，如烧伤科(31.25%)、外科(15.63%)、ICU(9.38%)，主要来源科室与李丽民 等[13]报道相似。其中pvl(+)MRSA主要来源于外科(57.14%)、新生儿病区(28.57%)、呼吸内科(14.29%)。可能因为烧伤科患儿第一道保护屏障皮肤的受损及体液的丢失，易导致各种病原菌的入侵；外科患儿因为手术创伤并常伴有身体免疫力的降低，易发生各种感染，要求临床医护人员手术过程中严格遵循无菌操作规则，术后加强对患儿的护理，避免感染；ICU患儿病情危重，加上机械插管、中心静脉导管静置等治疗设施更易发生各种感染，而一旦感染MRSA常导致病情加速恶化，甚至危及生命。本研究提示外科、烧伤科、ICU是儿童患者MRSA感染的常见科室，其中外科、新生儿病区、呼吸内科是pvl(+)MRSA感染的常见科室，因此要注意这些科室患儿感染金葡菌的mecA及pvl基因检测，以便进行及时有效的防治。

本研究结果显示，安徽省各地区儿童患者与>14岁患者感染MRSA主要来源标本之间差异有统计学意义(P<0.05)。提示儿童感染MRSA主要来源标本为脓液(31.25%)、痰(25.00%)、创面(15.63%)，pvl(+)MRSA主要来源于脓液(71.43%)、血(28.57%)，与相关报道[10]血、穿刺液、分泌物、脓液MRSA的检出率分别为68.97%、66.00%、55.81%、54.47%不一致。不一致原因可能为分离菌株来源地区范围、时间点不一样。提示安徽省各地区儿科患者MRSA主要来源于皮肤软组织感染，其次为呼吸系统感染，临床儿科医师应加强以上标本MRSA感染的意识，加强与检验医师的临床合作，注意以上标本金葡菌mecA及pvl基因的检测，以便更及时地发现MRSA感染患者并及时进行救治，从而达到更好的治疗效果。

本研究结果显示，安徽省各地区儿童患者与>14岁患者感染MRSA对多数常见抗生素的耐药性差异均无统计学意义(P>0.05)，但感染pvl(-)MRSA对庆大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平、四环素的耐药性差异有统计学意义(P=0.004、0.004、0.012、0.021、<0.001)，提示儿童与>14岁患者感染MRSA的耐药性多数相似，仅对以上几种抗生素的耐药性有差异，应注意根据年龄及pvl基因携带情况对以上药物进行合理应用。儿童感染pvl(+)MRSA与pvl(-)MRSA对克林霉素、环丙沙星、庆大霉素的耐药性差异具有统计学意义(P<0.001、<0.001、P=0.009)，提示儿童感染pvl(+)MRSA与pvl(-)MRSA具有不同的耐药模式。儿童感染pvl(+)MRSA主要表现对β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类、林克酰胺类耐药，其耐药率分别为100%、100%、28.6%、28.6%、14.3%；pvl(-)MRSA主要对β-内酰胺类、林克酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类、喹唑酮类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类等具有不同的耐药谱，其耐药率分别为100%、88%、80%、80%、76%、20%、16%、12%，与李冬梅 等[14]报道的MRSA耐药率相似，与魏丹丹 等[15]报道的MRSA耐药率有所不同，可能与各个地方的地理环境、用药习惯有关，提示不同地方的MRSA具有不同的耐药模式。当今社会由于抗生素的滥用，儿童感染MRSA的分离率逐年增加，且多为多重耐药菌，MSSA也开始出现耐药菌，给临床治疗带来巨大挑战，给患儿及家属带来巨大身心伤害，临床儿科医师应尽量避免经验用药，注意根据药敏结果制定治疗方案。