藏族人群甲状腺微小乳头状癌BRAFV600E基因突变及临床意义*

何丹,朱坪,刘林,江成浩,刘誉泽,陈祯勇

610041 成都,四川大学华西医院西藏成办分院 普外科

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是最常见的内分泌恶性肿瘤，约占所有甲状腺癌的85%～90%[1]。近30年来由于高分辨超声及细针穿刺学不断发展，全球大多数地区PTC的发病率逐年上升，我国亦呈上升趋势[2]，其中以直径≤1cm的甲状腺微小乳头状癌(papillary thyroid microcarcinoma，PTMC)为主[3]。尽管多数PTC，尤其是PTMC预后良好，但既往研究中仍有部分PTMC存在局部复发和淋巴结转移[4-5]，甚至有发生远处转移致死亡的报道。因此，如何鉴别具有侵袭性生物学行为的PTMC，对其进行最佳临床处理尚存挑战。BRAFV600E突变作为PTC最常见的基因突变形式，发生率约25%～82.3%。近期两项Meta分析结果显示，BRAF基因突变与PTC患者的腺外侵犯、淋巴结转移、复发及TNM分期有关[6-7]。但目前关于BRAF基因突变与PTMC的侵袭性是否相关尚缺乏共识[8-10]。本次研究通过搜集我科近3年住院的西藏PTMC患者，探究BRAFV600E基因突变与肿瘤侵袭性的关系，明确BRAFV600E是否可作为评估PTMC肿瘤生物学行为的分子标志，以期对PTMC患者提供最佳治疗策略。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2014年5月～2017年5月在我院就诊行手术治疗的69例PTMC患者的临床资料及病理组织，所有患者术前检测抗甲状腺过氧化物酶抗体、甲状腺球蛋白抗体水平，明确是否合并桥本氏甲状腺炎。术后均经病理证实为乳头状癌，并明确是否合并结节性甲状腺肿。本组病例男性5人(7.2%)，女性64人(92.8%)；年龄29～67岁，平均年龄47岁，其中<45岁33例(47.8%)，≥45岁36例(52.2%)；肿瘤直径≤5mm 29例(42.0%)，>5mm 40例(58.0%)。

1.2 BRAFV600E基因检测方法

将石腊块切成10mm石腊切片，经脱蜡、消化组织蛋白、去除RNA后，用核酸提取柱提取基因组DNA，采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测BRAFV600E基因 (人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒：厦门艾德生物医药科技有限公司；检测设备：ABI steponeplus 荧光定量PCR仪)，按试剂盒说明书利用 FAM基团标记的Taqman探针对扩增产物进行分析，若FAM通道有典型的S型扩增曲线升起，且Ct值≤32判断为样本BRAFV600E基因突变阳性；若无典S型扩增曲线升起，或Ct值大于32，则判定为阴性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，频数的比较采用χ2检验。以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床病理特征及BRAFV600E基因突变检测结果

69例PTMC中，46例为单发肿瘤(66.7%)，肿瘤呈多灶者23例(33.3%)；存在腺外侵犯21例(30.4%)；TNM分期按AJCC 2010版标准执行，T1期患者48例(69.6%)，T3期19例(27.5%)，T4期2例(2.9%)；术后病理证实存在淋巴结转移16例(23.2%)，其中2例伴有颈侧区淋巴结转移；所有患者均未检测出远处转移；临床分期I期患者54例(78.3%)，III/IV期15例(21.7%)；合并结节性腺肿18例(26.1%)，合并桥本甲状腺炎15例(21.7%)。42例样本检出BRAFV600E基因突变，基因突变率为 60.9%，详见表1。

表1 69例PTMC患者临床病理资料及BRAFV600E基因突变

Table 1. Clinicopathologic Data and BRAFV600EMutations in 69 PTMC Patients

VariableNo. of patientsPercentage(%)Sex Male57.2 Femal6492.8Age <45yrs3347.8 ≥45yrs3652.2Tumor size(mm) ≤52942.0 >54058.0Muliple foci No4666.7 Yes2333.3

(Table 1 continues on next page)

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VariableNo. of patientsPercentage(%)Extrathyroid invasion No4869.6 Yes2130.4T stage T14869.6 T31927.5 T422.9Lymph node metastases No5376.8 Yes1623.2Clinical stage I5478.3 III-IV1521.7Nodular goite No5173.9 Yes1826.1Hashimoto thyroiditis No5478.3 Yes1521.7BRAFV600E mutation No2739.1 Yes4260.9

2.2 BRAFV600E基因突变与PTMC临床病例特征的关系

BRAFV600E基因突变与PTMC患者性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)。BRAFV600E基因突变与肿瘤多灶性、腺外侵犯、淋巴结转移、TNM分期的关系经χ2检验有统计学意义。BRAFV600E基因突变阳性组，多灶肿瘤(P=0.036)、腺外侵犯(P=0.024)、淋巴结转移发生率(P=0.013)、III/IV期肿瘤患者构成比(P=0.021)要高于BRAFV600E基因突变阴性组，差异有统计学意义。(表2)

表2 BRAFV600E基因突变与PTMC患者临床病理特征的关系

Table 2. Correlation between BRAFV600EMutation and Clinicopathologic Characteristics of PTMC Patients

VariableBRAFV600E mutationNegativePositiveχ2PSex-0.073∗ Male41 Female2341Age2.0690.150 <45 yrs1023 ≥45 yrs1719Tumor size(mm)0.0300.862 ≤51118 >51624

VariableBRAFV600E mutationNegativePositiveχ2PMuliple foci4.3810.036 No2224 Yes518Extrathyroid invasion5.1120.024 No2325 Yes417Lymph node metastases6.2020.013 No2528 Yes214Clinical stage5.3550.021 I2529 III-IV213

*Fisher’s exact test

2.3 BRAFV600E基因突变与PTMC有无伴随病变的关系

69例PTMC中，合并结节性甲状腺肿18例，BRAFV600E基因突变率72.2%，不合并者51例，基因突变率56.9%，两者差异无统计学意义(P=0.251)；合并桥本氏甲状腺炎15例，BRAFV600E基因突变率为46.7%，不合并者54例，基因突变率为64.8%，两者差异无统计学意义(P=0.203)，详见表3。

表3 BRAFV600E突变状态与PTMC伴随病变的关系

Table 3. Correlation between BRAFV600EMutation and PTMC-associated Lesions

VariableBRAFV600E mutationNegativePositiveχ2PNodular goite1.3180.251 No2229 Yes513Hashimoto thyroiditis1.6230.203 No1935 Yes87

2.4 PTMC患者淋巴结转移与临床病理特征的关系

69例患者淋巴结转移率为23.2%，除BRAFV600E基因突变阳性外，存在肿瘤多灶性、腺外侵犯患者淋巴结转移率均显著增高(P<0.001)；而不同性别、年龄、肿瘤直径以及有无伴发结节性甲状腺肿、桥甲炎各组间差异均无统计学意义(P>0.05)(表4)。

表4 与淋巴结转移相关的临床病理特征

Table 4. Clinicopathologic Characteristics Associated with Lymph Node Metastases

VariableLymph nodemetastasesNoYesχ2PMuliple foci41.660<0.001 No460 Yes716Extrathyroid invasion25.405<0.001 No453 Yes813BRAFV600E mutation6.2020.013 Negative252 Positive2814

3 讨 论

PTMC并不都是不进展的亚临床状态，任何晚期PTC都是由PTMC进展而来。Guerra等[11]认为PTMC包含两个亚型：一部分生物学性质呈惰性，甚至终生无症状；另一部分可能合并高侵袭性组织学类型，在就诊时存在淋巴结转移或者术后发现隐匿性颈淋巴结转移，某些甚至在早期就出现远处转移。 因此，如何评估PTMC生物学行为，判断是否存在侵袭性，对临床治疗决策尤为重要。

BRAFV600E基因突变作为PTC最常见的突变形式，通过激活丝裂原活化的蛋白激酶信号通路，引起细胞不断增殖、肿瘤形成[12-13]，参与甲状腺癌的侵袭、转移。2015版美国甲状腺学会指南将BRAFV600E基因纳入了PTC复发风险分层，但对于直径≤1cm肿瘤并未明确提及。目前关于BRAFV600E基因突变与PTMC侵袭性的相关性仍具有争议。有研究显示，BRAFV600E突变与PTMC不良预后无必然联系[9]。但也有研究报道PTMC 不完全等同于低危 PTC，其两者生物学行为类似，不应被轻视[14]。

PTMC中BRAFV600E基因突变检出率可能由于样本来源、检测技术、病理学家操作水平、人种等种种原因存在差异。Ma等[15]学者通过对19篇原始研究进行系统评价发现BRAFV600E基因突变率为37.5%～71.7%，平均突变率为50.7%。此外，同欧美国家比较，东方人群中BRAFV600E基因突变发生率较高。本研究中藏族人群PTMC BRAFV600E基因突变率为60.9%，与国内学者张金苹等[16]的报道一致。

本研究显示PTMC患者BRAFV600E基因突变与性别、年龄、肿瘤大小、合并结节性甲状腺肿及桥本氏甲状腺炎无明显相关性，与既往研究报道基本一致[17]。本次研究结果证实PTMC患者BRAFV600E基因突变与肿瘤多灶性明显相关，与某些国外学者的研究存在差异[18]，这可能与样本量，检测方法不同有关。淋巴结转移、腺外侵犯、肿瘤TNM分期(III/IV期)作为评价肿瘤侵袭性临床病理特征，可预测肿瘤复发、转移、进展。既往报道在PTMC中淋巴结转移率为6%～66%[19]，本研究中藏族患者PTMC淋巴结转移率23.2%，其中14例存在BRAFV600E基因突变；此外，BRAFV600E基因突变还与肿瘤腺外侵犯、进展期PTMC相关，差异有统计学意义(表2)。因此藏族人群中存在BRAFV600E基因突变的PTMC表现出更具侵袭性的生物学行为。此研究结果与国内一些学者基于汉族人群的研究结果一致，部分PTMC可能合并高侵袭性组织学类型[20]。

淋巴结转移率高对患者不良预合有明显影响，而有无淋巴结转移是外科医师选择术式的关键。虽然术前彩超可评估淋巴结转移情况，但由于检测设备及操作人员的差别，检测结果可能存在假阴性，此为术后肿瘤迅速复发的主要原因之一。国内学者梁发雅[21]对117例cN0的PTMC患者行预防性中央区淋巴结清扫，术后病检提示淋巴结转移率约30%。而实施预防性中央区淋巴结清扫可增加总并发症及低钙血症的发生[22]。本次研究将淋巴结转移作为因变量进行分析发现，淋巴结转移与BRAFV600E基因突变、肿瘤多灶性、腺外侵犯明显相关，表明这些临床病理因素可以预测淋巴结转移情况，这与Liu等[23]学者的荟萃分析结果一致。因此，对PTMC患者行术前影像学检查联合BRAFV600E基因检测可以指导PTMC患者初次手术方案的制定，对是否行预防性淋巴结清扫提供依据。

综上所述，藏族人群中PTMC患者BRAFV600E基因突变较为多见，且PTMC并非都是低危肿瘤，与肿瘤多灶、侵袭、转移及临床分期相关，可作为筛选高危PTMC患者的分子标记，评估预后并指导个体化治疗。但PTMC发生发展过程是否有其他分子事件参与，仍需进一步研究。

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