HPLC法测定替尼泊苷在不同pH缓冲液中油水分配系数

李海珍，姚慧敏，胡彦武 ，越 皓

替尼泊苷（Teniposide，VM-26）又称4 ′-去甲基表鬼臼毒素-BETA-D-噻吩亚甲基吡喃葡萄糖苷，是在鬼臼毒素的结构基础上修饰得到的半合成衍生物.VM-26作为一种广谱化疗药物，可用于如淋巴细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病等实验性诱导白血病，婴儿非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、腹水肿瘤、恶性脑瘤、结肠直肠及难治性或复发性睾丸癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌等多种癌症的治疗［1-5］.VM-26为一种细胞周期特异性细胞毒性药物，通过抑制DNA拓扑异构酶-II（DNA-topo-II）的活性稳定DNA复制中的DNA-topo-II复合物，从而破坏DNA，诱导细胞凋亡［6-8］.在临床应用中常与其他药物如顺铂、磷替莫司汀和地塞米松等联合使用而达到更好的治疗效果，降低其毒副作用［9-15］.

油水分配系数（Partition coefficient，P）是药物的一个基础参数，并已被用作确定定量结构-活性关系（QSAR）的主要参数［1］.P的大小直接影响药物的渗透性，从而影响药物在体内的吸收分布过程，因此与各种药物的临床疗效密切相关.目前还未发现VM-26P值测定的有关文献报道.

本研究采用摇瓶法，建立HPLC法测定VM-26在正辛醇-水中的P值，并研究不同pH对其结果的影响，为开发和研制VM-26新剂型提供参考依据.

1 实验仪器与试剂

1.1 实验仪器

Waters高效液相色谱仪:配有Alliance 2695型四元梯度输液泵、Alliance 2695进样器、2489 PDA检测器，KQ2200E型超声波清洗仪；SOP电子天平；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；TGL-16B高速离心机；KYC-100C空气恒温摇床.

1.2 实验试剂

试剂:替尼泊苷（批号:210790，长沙祯祥生物科技有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯.

2 实验方法

2.1 样品的制备

2.1.1 不同pH磷酸盐缓冲液的制备

照《中国药典》（2015年版四部）8004缓冲液的配制方法配制pH分别为5.0、5.8、6.5、7.4和8.0的磷酸盐缓冲液（PBS）.

pH1.2盐酸溶液配制:取浓盐酸2mL加入200mL纯水中，加盐酸使pH至1.2，即得.

2.1.2 水饱和正辛醇溶液及正辛醇饱和水溶液的制备

分别精密量取正辛醇和水相（包括pH1.2盐酸溶液和pH为5.0、5.8、6.5、7.4和8.0的PBS缓冲液）各200mL于500mL具塞锥形瓶中，于25℃下磁力搅拌24h后，静置过夜，取上层作为水饱和正辛醇溶液，取下层作为正辛醇饱和水溶液.

2.1.3 对照品溶液的配制

精密称取VM-26适量，加甲醇制备成0.2mg·mL-1的VM-26储备液，加甲醇稀释配制成10μg·mL-1的VM-26对照品溶液.

2.1.4 供试品溶液的制备

精密称取VM-26 10mg于100mL容量瓶中，加水饱和正辛醇超声30min溶解后定容，得到VM-26贮备液.精密取VM-26储备液2mL，精密加入同体积的水相溶液（pH1.2盐酸溶液与pH分别为5.0、5.8、6.5、7.4和8.0的 PBS缓冲液）于10mL具塞塑料管中，于25℃下在恒温摇床中振摇24h，使药物平衡分布在油水两相中4000r·min-1离心10min，取上层正辛醇溶液1mL于10mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，即得VM-26供试品溶液.

2.2 检测波长的确定

取VM-26适量，以甲醇为溶剂制备浓度为10μg·mL-1的VM-26溶液，以乙腈-0.1%磷酸缓冲液（50:50）为流动相，使用PDA检测器于210～400nm进行扫描，得到色谱图如图1，在230nm和280nm处各有一吸收峰值，参照国家药品标准所用波长为280nm，因此选用280nm作为检测波长.

图1 VM-26溶液的色谱图

2.3 色谱条件

色谱柱:WatersSymmetryC18柱（4.6×250mm，5μm），流动相:乙腈-0.1%磷酸缓冲液（50:50），流速:1mL·min-1，检测波长:280nm，柱温:30℃，进样量:10μL.理论塔板数按VM-26计应不低于3000.

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性试验

分别取VM-26对照品溶液、VM-26供试品溶液（水饱和正辛醇为溶剂）进样HPLC检测，记录色谱图.

2.4.2 标准曲线

精密量取VM-26储备液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL和5.0mL于10mL容量瓶中，加甲醇制备成浓度分别为2μg·mL-1、4μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、100μg·mL-1系列VM-26溶液进样分析，以VM-26浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），用最小二乘法进行线性回归.

2.4.3 精密度试验

取VM-26对照品溶液进样HPLC检测，日内重复进样5次，连续进样3天，记录峰面积，计算日内、日间RSD%.

2.4.4 稳定性试验

取“2.1.4”项下的供试品溶液，分别在磁力搅拌0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h后取样，进HPLC检测，计算RSD%.

2.4.5 回收率试验

分别精密称定VM-26 8mg、10mg和12mg VM-26于100mL容量瓶中，加水饱和正辛醇溶液稀释并定容，取上述溶液加甲醇稀释得到浓度为 8μg·mL-1、10μg·mL-1和 12μg·mL-1供试品溶液，每个浓度平行3份样品.进HPLC检测，记录峰面积，计算得到平均回收率及RSD%.

2.3 VM-26油水分配系数的测定

2.3.1 不同正辛醇-水比例VM-26P值的测定

本试验设计3个正辛醇/水的比例进行P值的测定.取VM-26储备液2mL 3份，分别加入1mL、2mL和4mL正辛醇饱和水溶液，按照“2.1.4”项下方法制备VM-26溶液，进HPLC检测，计算正辛醇中VM-26平衡浓度.同时取VM-26储备液1mL于10mL容量瓶中，加甲醇定容后进HPLC检测，记录峰面积并计算正辛醇中含药量浓度.并采用下列公式计算P值，结果见表1，正辛醇与水例为2∶1与2∶4时P值相差不大，因此选择油水比例为2∶2.

式中:P为VM-26的油水分配系数；Cn-o为正辛醇中VM-26平衡浓度；Cn正辛醇中初始含药量浓度.

2.3.2 不同pH条件下P值的测定

取“2.1.4”项下的VM-26储备液2mL 6份，分别加入正辛醇饱和pH1.2盐酸溶液、pH5.0、pH5.8、pH6.5、pH7.4及pH8.0的PBS缓冲溶液，照“2.2.2”项下方法测定，记录峰面积，计算正辛醇中含药量浓度并计算P值.

3 实验结果

3.1 方法学验证结果

3.1.1 专属性试验

VM-26对照品溶液、VM-26供试品溶液色谱图见图2，结果理论塔板数不低于3000，分离度大于1.5.

图2 VM-26对照品溶液与供试品溶液色谱图

3.1.2 标准曲线

以VM-26浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得出回归方程y=6001.4x-5669.6（R=0.9993），结果表明VM-26质量浓度在2～100μg·mL-1内线性关系良好.

3.1.3 精密度试验

VM-26对照品溶液在日内、日间RSD%分别为0.43%、1.02%，结果表明该方法精密度良好.

3.1.4 稳定性试验

供试品溶液搅拌24h内样品RSD%为1.67，结果表明VM-26供试品溶液在24h内基本稳定.

3.1.5 回收率试验

VM-26高、中、低三个浓度的平均回收率为100.84%，RSD%为1.79%，表明该方法准确度良好.

3.2 VM-26油水分配系数的测定

3.2.1 不同正辛醇-水比例VM-26P值的测定

在不同正辛醇-水比例条件下VM-26P值的测定结果见表1，正辛醇与水例为2∶1与2∶4时P值相差不大，因此选择油水比例为2∶2.

表1 不同正辛醇-水比例VM-26P值的测定

3.2.2 不同pH条件下P值的测定

在不同pH条件下VM-26P值的测定结果见表2及图3，pH=7.4时lgP值最大，pH=6.5lgP值最小，所有水相中的lgP值均大于2且无明显差异.

表2 不同pH条件下P值的测定结果

图3 不同PH条件下P值的测定结果

4 讨论

P值测定的方法主要有摇瓶法、反相高效液相色谱法和产生柱法，其中，反相高效液相色谱法需建立已知P值对照品的标准曲线，成本较高；而产生柱法测定步骤较多，平衡时间长.亦有文献采用硅膜平衡器法和固相微萃取法［16］，该方法操作复杂，成本较高.因此选用摇瓶法进行P值测定，此法成本较低、易于操作.选择油相应与水相互不相溶，目前文献多以正辛醇作为油相［17-18］，主要是由于正辛醇与水互不相溶，且极性与生物膜相似［19］，因此本试验选择正辛醇-水作为分配体系.

VM-26水溶性差，水中的VM-26浓度太低无法检出，故本试验将VM-26溶于油相中，通过测定平衡前水饱和正辛醇的含药量和平衡后正辛醇含药量之差来计算水相中含药量，进一步计算VM-26P值.正辛醇-水分配体系中彼此会有少许溶解，因此在实验前应先预饱和正辛醇与水，以免在实验过程中水与正辛醇之前相互分配平衡，影响实验结果［17］.

药物的P值与药物在体内吸收、分布和转运密切相关，P值越大则生物膜的渗透性越高，有利于药物在体内的吸收［20-21］.而药物最佳的P值分布范围是-1

结果显示，VM-26在pH5.0～8.0时，其lgP值均大于2，表明药物脂溶性好，在体内渗透性高；随着pH变化无明显差异，VM-26在缓冲溶液中以非解离型药物形式存在，不发生电离.上述结论为研究开发更加有效、安全的各种VM-26制剂提供一定参考价值.