姜黄素中枢给药对胰岛素抵抗小鼠的改善作用及其机制研究

钱伟伦，高修滨，于志文，南丽红

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

中枢神经系统在机体外周组织的胰岛素敏感性调节中发挥非常重要的作用，近年来已逐渐成为一个研究热点［1］。中枢下丘脑氧化应激会造成下丘脑的炎症反应和内质网应激，可以诱发外周整体胰岛素抵抗和糖代谢紊乱［2-4］。中枢给药可避过血脑屏障的影响，直接观察药物通过中枢对外周组织胰岛素抵抗的影响。姜黄素是从姜科植物郁金块根、姜黄根茎、莪术根茎以及天南星科植物菖蒲根茎等中提取出来的一种黄色酸性酚类物质，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗纤维化等生物学活性［5］。近年来，研究发现姜黄素对胰岛素抵抗具有较好的治疗作用［6-8］。姜黄素能部分通过血脑屏障，不排除姜黄素外周给药对中枢影响。姜黄素中枢给药是否可以调控外周胰岛素抵抗，目前报道较少，故本研究采用姜黄素中枢给药观察其对高脂诱导的胰岛素抵抗小鼠的作用，并探讨其可能的作用机制，进一步了解姜黄素改善胰岛素抵抗的机制，为今后姜黄素治疗糖尿病的临床转化提供一定的实验依据。

1 实验材料

1.1 动物和饲料 6周龄雄性SPF级C57BL／6J小鼠购自于上海斯莱克实验动物有限责任公司［许可证号码：SCXK（沪）2017-0005］，饲养在福建医科大学实验动物中心［许可证号：SYXK（闽）2016-0006］；低脂饲料（脂肪含量4.5%）、高脂饲料（脂肪含量60%）购自于广东省医学实验动物中心［许可证号：SCXK（粤）2013-002］。

1.2 试剂与耗材 胰岛素（丹麦诺和诺德生物技术有限公司）；姜黄素（上海源叶生物科技有限公司）；DMSO（美国 Sigma公司）；蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）、PKBSer473、 核糖体蛋白 S6 和 p-S6抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和内参GAPDH抗体（美国Santa Cruz公司）；鼠二抗和兔二抗（美国Thermo Scientific公司）；硝酸纤维素膜（北京索莱宝科技有限公司）；ECL显影液（康为世纪生物科技有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；血糖仪、血糖试纸（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司）；导管、导管帽（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；10μL微量注射器（上海高鸽工贸有限公司）。

1.3 主要仪器 台式冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司）；小型垂电泳槽、小型转印槽、基础电泳仪电源和转膜夹（美国Bio-Rad公司）；摇床（海门其林贝尔仪器制造有限公司）；酶标仪（奥地利Tecan公司）；ChemiDocXRS化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 药物的配制 姜黄素20 mg加入0.543 mL的DMSO配制成100 mmol／L的姜黄素母液于-20℃冰箱保存。实验时将40μL姜黄素母液加入60μL的DMSO稀释成最终浓度为40 mmol／L备用。

2.2 模型的制备和给药方法 6周龄雄性SPF级C57BL／6小鼠在适应性喂养1周后，将其随机分为低脂组（LF 组，n＝8）和高脂组（n＝16），分别给予低脂饲料和高脂饲料饲养12周。饲养期间每周对小鼠进行称重，12周后进行葡萄糖耐量测定，若高脂组每只小鼠的体重达到40 g，葡萄糖耐量明显高于低脂组小鼠（P＜0.05），提示模型复制成功。将造模成功的高脂组小鼠随机分为高脂模型组（HF组，n＝8）和姜黄素组（Cur组，n＝8）。 各组小鼠均进行侧脑室埋管，埋管手术恢复2 h后，侧脑室注射给药连续3 d，1次／d。LF组和HF组侧脑室注射生理盐水 4μL，Cur组侧脑室注射40 mmol／L姜黄素溶液 4μL。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 葡萄糖糖耐量的检测 禁食不禁水12 h后，于次日早上每只小鼠腹腔注射葡萄糖 （1.8 g／kg），于腹腔注射后 0、15、30、60及 120 min剪小鼠尾尖取静脉血，事先将血糖试纸插入血糖仪中，然后把血滴在血糖试纸指示孔上检测血糖水平。

2.3.2 取材 末次给药后，禁食不禁水12 h，待测完葡萄糖耐量后各组小鼠均腹腔注射胰岛素（0.3 U／kg）。15 min后，断头处死小鼠，迅速取其肝脏组织置于预冷的生理盐水中漂洗，并迅速将其放入液氮中，待取材完毕后将所有样品放入-80℃冰箱中储存，备用。

2.3.3 肝脏蛋白提取 将裂解液提前解冻放置在冰上，取40 mg左右的肝脏组织，加入裂解液400 μL于组织研磨器中研磨，研磨至液体无组织碎片可视为匀浆完成；然后将组织匀浆液转移至1.5 mL的离心管中，冰上放置30 min，期间每隔10 min震荡 1次；30 min后在离心机中 4℃，14 000 r／min离心10 min；取上清液，用BCA法测定蛋白浓度；制成统一蛋白浓度为2μg／μL的蛋白样品。

2.3.4 Western blot法检测 PEPCK、G6Pase蛋白的表达量和PKB、S6蛋白磷酸化水平 每孔上样20 μL即上样量为40μg进行蛋白质电泳；电泳结束后进行转膜，将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；转膜完成后进行丽春红染色，观察转膜情况；用TBST洗去丽春红，5%的脱脂牛奶封闭2 h；TBST洗膜 5 min，4次；将NC膜放置在 PKBSer 473、PKB、S6、p-S6、PEPCK 和 G6Pase（1∶1000）中，再放置于冰上，摇床摇晃过夜；回收一抗，洗膜4次，每次5 min；洗膜完后用5%BSA稀释过的二抗（1∶5000）孵育 2 h；TBST 洗膜 4次，每次 5 min；用 ECL显影液显影。Image Lab图像分析软件对条带灰度值进行定量分析，GAPDH作为内参蛋白，以各组的蛋白条带灰度值与内参蛋白灰度值的相对比值表示各组蛋白的相对表达量。

2.4 统计学方法 使用SPSS 22.0统计软件分析实验数据。计量资料符合正态分布的以（±s）表示，2组比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析；等级资料采用秩和检验。

3 结 果

3.1 2组小鼠体重和血糖值比较 见图1、图2。高脂饲料喂养小鼠12周后，HF组与LF组比较体重明显升高（P＜0.01），同时HF组糖耐量受到明显损害，在 0、15、30、60 和 120 min 高脂组的血糖值均明显高于LF组。

图1 2组小鼠体重比较

图2 2组小鼠血糖值比较

3.2 3组小鼠葡萄糖耐量血糖比较 见图3。HF组血糖与LF组比较明显升高（P＜0.01），Cur组与HF组比较显著降低（P＜0.05）。

图3 3组小鼠葡萄糖耐量血糖比较

3.3 3组小鼠肝组织中PEPCK、G6Pase蛋白表达量和PKB、S6蛋白磷酸化水平（PKBSer473、p-S6蛋白表达量）比较 见图4、图5。中枢给药前HF组较LF组PKB和S6蛋白磷酸化水平明显降低（P＜0.01），而HF组较LF组小鼠葡萄糖耐量和肝组织中PEPCK、G6Pase蛋白表达量明显增高（P＜0.01）。姜黄素中枢给药3 d后，Cur组小鼠肝组织中PKB和S6蛋白磷酸化水平明显高于HF组（P＜0.05），而肝组织中PEPCK和G6Pase蛋白表达量明显低于HF 组（P＜0.05）。

3 讨 论

图4 3组小鼠肝组织中PKB、S6蛋白磷酸化水平比较

图5 3组小鼠肝组织中PEPCK、G6pase表达比较

随着现代人们生活水平的提高，高热量食物的摄入和较少的体力运动消耗等，造成机体能量以脂肪形成的存储从而造成异常和肥胖发病率的急剧升高，而肥胖与胰岛素抵抗和2型糖尿病之间的联系十分紧密［8］。本研究选用的高脂饲料喂养制备胰岛素抵抗动物模型的方法可靠性高、饲养方便且价格相对较低，目前被视为是胰岛素抵抗动物模型的常规制备方法之一［9］。

胰岛素信号传导及功能受损是导致胰岛素抵抗的重要因素［10］。在2型糖尿病患者中，肝脏的糖异生作用大大增强，这与胰岛素抑制肝脏的内源性葡萄糖生成的功能受到损害关系密切，其中糖异生作用的关键限速酶G6Pase和PEPCK是调控糖异生速度的核心作用点［11］。肝脏的胰岛素信号通路能调控肝脏的糖异生，并可以调控PEPCK和G6Pase 的表达［12－13］。 有研究表明：在发生胰岛素抵抗时，胰岛素信号通路中的重要调节因子PKB和S6的磷酸化水平降低［14］，我们的研究显示姜黄素中枢给药可以降低PEPCK和G6Pase蛋白的表达，提高PKB和S6的磷酸化水平。

综上所述，姜黄素中枢给药后可明显改善高脂模型小鼠的胰岛素抵抗作用，其作用可能与增强肝脏胰岛素信号通路相关因子PKB、S6蛋白磷酸化水平和抑制肝脏糖异生有关。